TP amilasa

Trabajo Práctico 5:

Actividad Enzimática de la α-amilasa

Alumnos; Cruz Ferrer Vieyra, Yvan Doctorovich, Emiliano Kalesnik.

Grupo : 1

Introducción

Tomando una muestra de saliva, que contiene la enzima α-amilasa (Enzima que degrada los enlaces  α(1-4) del almidón, en sus formas de amilosa completamente y en su forma de amilopectina dejando un núcleo grande y muy ramificado llamado dextrina límite), haremos experimentos de su actividad enzimática en diferentes situaciones y con distintos pre-tratamientos (Efectuados antes de poner a la dicha enzima con el almidón)

Objetivo

Los objetivos de este trabajo son:

• Ver cómo trabaja la α-amilasa en condiciones diferentes a las de nuestro cuerpo (Diferente pH o temperatura).
• Probar que su actividad enzimática depende de las proteínas que la conforman con el uso de proteasas.
• Probar que al desnaturalizarse por completo no puede volver a su estado activo de catalizadora.

Método

Tomamos una muestra de saliva de 2ml, y medimos su pH. Luego diluimos 0,5ml de la muestra en 9,5ml de agua para hacer una dilución 1/20. Pusimos su actividad enzimática a prueba poniendo 1ml de la solución en almidón (a 37°C, pH de aproximadamente 7 y sin ningún pre-tratamiento en la enzima) y tomamos muestras cada 30 segundos poniéndolas en Lugol (compuesto que reacciona con el almidón y se vuelve azul, previamente diluido 1/800 de la solución stock). En la muestra de los 2 minutos y medio la solución quedó, a simple vista, transparente, por lo que había sido degradado el almidón.

Sin embargo para experimentar correctamente tenía que darnos un tiempo de degradación de entre 3 y 8 minutos, por lo que diluimos 5ml de la muestra ya diluida en 5ml de agua, quedando una dilución 1/40 de la muestra original. Esta vez nos dio un tiempo de degradación de 3 minutos por lo que tomamos esta dilución como la dilución óptima, y 3 minutos como tiempo de referencia.

A nuestro grupo le tocó experimentar con un pre-tratamiento de la enzima a 100°C, y su actividad a 0°C y 50°C.

Para el pre-tratamiento a 100°C pusimos 1ml de la solución en un tubo eppendorf, y lo dejamos por 10 minutos bañándose en una olla con agua a 100°C, para luego ver su actividad en condiciones “normales”. Debido a que la desnaturalización de esta enzima no es reversible esperaríamos que no haya actividad.

Para experimentar con su actividad a 0°C y a 50°C, sin ningún pre-tratamiento, simplemente hicimos los pasos anteriores pero poniendo el almidón en hielo o en un baño de agua a 50°C respectivamente.

Resultados

La Temperatura Ambiente en el momento que realizamos el trabajo era de 24 °C.

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