Transformacion Genetica
Enviado por dany123456789 • 19 de Agosto de 2014 • 4.237 Palabras (17 Páginas) • 272 Visitas
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Los pasos necesarios para la purifi cacion de acidos nucleicos son muy distintos de los que se emplean en la purifi - cacion de proteinas, lo que refl eja la diferencia basica en la estructura de estos dos tipos de macromoleculas. El primer paso en la purifi cacion de DNA suele ser la homogeneizacion de celulas y el aislamiento de los nucleos de los que se extrae el DNA. Los nucleos luego se extraen con una solucion salina la solucion se eleva mucho cuando el DNA se libera. El detergente
tambien inhibe cualquier actividad de nucleasa presente
en la preparacion.El principal objetivo de los siguientes pasos de la purifi cacion
es separar el DNA de los materiales contaminantes, como el RNA y las proteinas. Por lo general la eliminacion de proteinasse efectua al agitar la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o fenol/cloroformo como alternativa) es un desnaturalizante
activo de las proteinas que causa que las proteinas de la preparacion pierdan su solubilidad y se precipiten en la solucion. Como el fenol y las soluciones salinas amortiguadas son inmiscibles, suspension solo se centrifuga para separar las fases, lo que deja el DNA (y el RNA) en solucion con la fase acuosa superior y la proteina presente como precipitado en el limite entre las dos fases. La fase acuosa se retira del tubo y se sometea ciclos repetidos de agitacion con fenol y centrifugacion hasta
que ya no se retire mas proteina de la solucion. Despues los acidos
nucleicos se precipitan de la solucion con la adicion de etanol
frio. Con frecuencia el etanol frio forma una capa arriba de
la solucion acuosa de DNA y el DNA se enrolla en un cilindro
de vidrio conforme sale de la solucion en la interfase entre el
etanol y la solucion salina. En cambio, el RNA sale de la solucion
como un precipitado fl oculento que se asienta en el fondo
del recipiente. Despues de este procedimiento de purifi cacion
inicial el DNA se disuelve de nuevo y se trata con ribonucleasa
para retirar el RNA contaminante. A continuacion la ribonucleasa
se destruye con una proteasa, que se retira mediante desproteinizacion
con fenol, y el DNA se precipita con etanol.
El RNA puede purifi carse en forma similar con DNAasa
en los pasos fi nales de la purifi cacion en lugar de ribonucleasa.
En 1987 se publico un procedimiento alternativo para aislar
RNA en un solo paso. En esta tecnica, los tejidos se homogeneizan
en una solucion que contiene tiocianato de guanidina 4 M y
el extracto de RNA se mezcla con fenol y se agita con cloroformo
(o bromocloropropano). Despues la suspension se centrifuga,
lo que deja el RNA en la fase acuosa superior y el DNA y la
proteina en el cambio de una fase a otra.
En un metodo alternativo de purifi cacion de DNA se usan
membranas o matrices a las cuales el DNA se unira en condiciones
especifi cas. Para purifi car DNA usando uno de estos materiales,
las celulas se lisan en una solucion que facilita la union
selectiva del DNA a la matriz. El lisado se aplica a la matriz y los
contaminantes se eliminan del DNA mediante lavado. Por ultimo,
la matriz se enjuaga del DNA con un amortiguador eluente.
A menudo estas matrices se apilan en diminutas columnas dentro
de tubos de centrifuga, para que los pasos de union, lavado y
elucion puedan realizarse de modo efi ciente mediante la aplicacion
de una fuerza centrifuga.
y secuencia de nucleotidos. Por tanto, los metodos de fraccionamiento
para acidos nucleicos se basan en estas caracteristicas.
Separación de DNA por electroforesis en gel
De las diversas tecnicas empleadas en el fraccionamiento de
proteinas descritas antes, una de ellas, la electroforesis en gel,
tambien se usa mucho para separar acidos nucleicos con masa
molecular diferente (o sea, longitud del nucleotido). Las moleculas
pequenas de RNA o DNA de unos cuantos cientos de
nucleotidos o menos casi siempre se separan por electroforesis
en gel de poliacrilamida. Las moleculas mas grandes tienen problemas
para pasar por la poliacrilamida de enlaces cruzados y
por lo general se fraccionan en gel de agarosa, que es mas poroso.
La agarosa es un polisacarido extraido de un alga marina; se
disuelve con un amortiguador caliente, se vierte en un molde y
se gelatiniza con el simple descenso de temperatura. La separacion
de moleculas de DNA mayores de 25 kb suele hacerse
mediante la tecnica de electroforesis en campo con pulsos en la
que la direccion del campo electrico en el gel se cambia en forma
periodica, lo que ocasiona que las moleculas de DNA se reorienten
durante la migracion.
Despues de la electroforesis, los fragmentos de DNA en el
gel se visualizan empapando el gel en una solucion de colorante
como bromuro de etidio. Este se intercala en la doble helice y
hace que las bandas de DNA presenten fl uorescencia cuando se
...