Transformacion Genetica

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Los pasos necesarios para la purifi cacion de acidos nucleicos son muy distintos de los que se emplean en la purifi - cacion de proteinas, lo que refl eja la diferencia basica en la estructura de estos dos tipos de macromoleculas. El primer paso en la purifi cacion de DNA suele ser la homogeneizacion de celulas y el aislamiento de los nucleos de los que se extrae el DNA. Los nucleos luego se extraen con una solucion salina la solucion se eleva mucho cuando el DNA se libera. El detergente

tambien inhibe cualquier actividad de nucleasa presente

en la preparacion.El principal objetivo de los siguientes pasos de la purifi cacion

es separar el DNA de los materiales contaminantes, como el RNA y las proteinas. Por lo general la eliminacion de proteinasse efectua al agitar la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o fenol/cloroformo como alternativa) es un desnaturalizante

activo de las proteinas que causa que las proteinas de la preparacion pierdan su solubilidad y se precipiten en la solucion. Como el fenol y las soluciones salinas amortiguadas son inmiscibles, suspension solo se centrifuga para separar las fases, lo que deja el DNA (y el RNA) en solucion con la fase acuosa superior y la proteina presente como precipitado en el limite entre las dos fases. La fase acuosa se retira del tubo y se sometea ciclos repetidos de agitacion con fenol y centrifugacion hasta

que ya no se retire mas proteina de la solucion. Despues los acidos

nucleicos se precipitan de la solucion con la adicion de etanol

frio. Con frecuencia el etanol frio forma una capa arriba de

la solucion acuosa de DNA y el DNA se enrolla en un cilindro

de vidrio conforme sale de la solucion en la interfase entre el

etanol y la solucion salina. En cambio, el RNA sale de la solucion

como un precipitado fl oculento que se asienta en el fondo

del recipiente. Despues de este procedimiento de purifi cacion

inicial el DNA se disuelve de nuevo y se trata con ribonucleasa

para retirar el RNA contaminante. A continuacion la ribonucleasa

se destruye con una proteasa, que se retira mediante desproteinizacion

con fenol, y el DNA se precipita con etanol.

El RNA puede purifi carse en forma similar con DNAasa

en los pasos fi nales de la purifi cacion en lugar de ribonucleasa.

En 1987 se publico un procedimiento alternativo para aislar

RNA en un solo paso. En esta tecnica, los tejidos se homogeneizan

en una solucion que contiene tiocianato de guanidina 4 M y

el extracto de RNA se mezcla con fenol y se agita con cloroformo

(o bromocloropropano). Despues la suspension se centrifuga,

lo que deja el RNA en la fase acuosa superior y el DNA y la

proteina en el cambio de una fase a otra.

En un metodo alternativo de purifi cacion de DNA se usan

membranas o matrices a las cuales el DNA se unira en condiciones

especifi cas. Para purifi car DNA usando uno de estos materiales,

las celulas se lisan en una solucion que facilita la union

selectiva del DNA a la matriz. El lisado se aplica a la matriz y los

contaminantes se eliminan del DNA mediante lavado. Por ultimo,

la matriz se enjuaga del DNA con un amortiguador eluente.

A menudo estas matrices se apilan en diminutas columnas dentro

de tubos de centrifuga, para que los pasos de union, lavado y

elucion puedan realizarse de modo efi ciente mediante la aplicacion

de una fuerza centrifuga.

y secuencia de nucleotidos. Por tanto, los metodos de fraccionamiento

para acidos nucleicos se basan en estas caracteristicas.

Separación de DNA por electroforesis en gel

De las diversas tecnicas empleadas en el fraccionamiento de

proteinas descritas antes, una de ellas, la electroforesis en gel,

tambien se usa mucho para separar acidos nucleicos con masa

molecular diferente (o sea, longitud del nucleotido). Las moleculas

pequenas de RNA o DNA de unos cuantos cientos de

nucleotidos o menos casi siempre se separan por electroforesis

en gel de poliacrilamida. Las moleculas mas grandes tienen problemas

para pasar por la poliacrilamida de enlaces cruzados y

por lo general se fraccionan en gel de agarosa, que es mas poroso.

La agarosa es un polisacarido extraido de un alga marina; se

disuelve con un amortiguador caliente, se vierte en un molde y

se gelatiniza con el simple descenso de temperatura. La separacion

de moleculas de DNA mayores de 25 kb suele hacerse

mediante la tecnica de electroforesis en campo con pulsos en la

que la direccion del campo electrico en el gel se cambia en forma

periodica, lo que ocasiona que las moleculas de DNA se reorienten

durante la migracion.

Despues de la electroforesis, los fragmentos de DNA en el

gel se visualizan empapando el gel en una solucion de colorante

como bromuro de etidio. Este se intercala en la doble helice y

hace que las bandas de DNA presenten fl uorescencia cuando se

ven con radiacion ultravioleta (fi g. 18-34). La sensibilidad de la

electroforesis en gel es tan alta que moleculas de DNA o RNA

que difi eren por un solo nucleotido pueden separarse con esta

tecnica, una caracteristica que dio origen a un metodo invaluable

para la secuenciacion del DNA (pag. 766). Dado que la rapidez

de migracion por un gel tambien puede ser afectada por la

forma de la molecula, es posible usar la electroforesis para separar

moleculas con diferente conformacion, como formas circular

y lineal o relajada y superenrollada (vease fi g. 10-12).

Separación de ácidos nucleicos

por ultracentrifugación

La experiencia indica que la estabilidad de una solucion (o suspension)

depende de los componentes. La crema fl ota sobre la

leche cruda, un precipitado fi no se asienta en forma gradual en el

fondo del recipiente y una solucion de cloruro de sodio permanece

estable por tiempo indefi nido. Muchos factores determinan

si un componente se asienta o no en un medio liquido; estos

factores incluyen el tamano, la forma y la densidad de la sustancia,

asi como la densidad y la viscosidad del medio. Si un componente

de una solucion o suspension es mas denso que el medio,

la fuerza centrifuga determina que se concentre en el fondo de

un tubo de la centrifuga. Las particulas mas grandes se sedimentan

con mas rapidez que las pequenas de forma y densidad similares.

La tendencia de las moleculas a concentrarse durante la

centrifugacion se contrarresta por los efectos de la difusion, que

ocasiona que las moleculas se redistribuyan de modo mas uniforme

(aleatorio). El desarrollo de las ultracentrifugas permitio

generar fuerzas centrifugas de hasta 500 000 veces la fuerza de la

gravedad, que son lo bastante grandes para contrarrestar los efectos

de la difusion y hacen que las macromoleculas se sedimenten

hacia el fondo de un tubo de centrifuga. La centrifugacion se

TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

En los ultimos 30 anos se realizaron grandes avances en

el analisis de los genomas eucariotas. Este progreso comenzo

cuando los biologos moleculares aprendieron a construir moleculas

de DNA recombinante, que son moleculas que contienen

secuencias de DNA derivadas de mas de una fuente. El DNA

recombinante puede usarse en multitud de formas. Para empezar

se considerara una de las aplicaciones mas importantes: el

aislamiento del genoma de un segmento particular de DNA que

codifi ca un polipeptido determinado. No obstante, resulta necesario

considerar primero una clase de enzimas cuyo descubrimiento

y uso han hecho posible la formacion de moleculas de

DNA recombinante.

Endonucleasas de restricción

Durante el decenio de 1970 se encontro que las bacterias contenian

nucleasas que reconocian secuencias cortas de nucleotidos

dentro de un DNA doble y dividian la columna central del

DNA en sitios especifi cos en ambas cadenas de la helice doble.

Estas enzimas se conocen como endonucleasas de restricción o

solo enzimas de restricción. Reciben este nombre porque en las

bacterias funcionan para destruir el DNA virico que pudiera

entrar a la celula, lo que restringe el crecimiento de los virus. La

bacteria protege su propio DNA del ataque nucleolitico mediante

la metilacion de las bases en los sitios susceptibles, una modifi

cacion quimica que bloquea la accion de la enzima.

Se aislan enzimas de varios cientos de organismos procariotas

distintos que, en conjunto, reconocen mas de 100 secuencias

de nucleotidos diferentes. Las secuencias que la mayoria de

las enzimas reconocen miden cuatro a seis nucleotidos de largo

y se caracterizan por un tipo particular de simetria interna.

Considerese la secuencia particular reconocida por la enzima

EcoR1:

3′ CTTAAG 5′

5′ GAATTC 3′

Se dice que este segmento de DNA tiene simetría rotatoria doble

porque puede girarse 180° sin que la secuencia de bases cambie.

Por tanto, si la secuencia se lee en la misma direccion (3′ a 5′ o5′ a 3′) en cualquiera de las cadenas se encuentra el mismo orden

de bases. Una secuencia con este tipo de simetria

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