Transformación de la cepa bacteriana DH5a con plásmido pENTER en presencia de Kanamicina

Transformación de la cepa bacteriana DH5a con plásmido pENTER en presencia de Kanamicina  

Frida Jimena Sánchez Luna1

1Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Resumen

E. coli perteneciente a la cepa bacteriana DH5a resulta ser un modelo muy eficaz para el estudio de transformación bacteriana, durante este fenómeno se lleva a cabo la introducción de un plásmido pENTER de procedencia exógena a  una bacteria, este plásmido le confiere la capacidad de sobrevivir ante condiciones de Kanamicina, antibiótico ante el cual la cepa DH5a es sensible. Para poder observar la transformación bacteriana se pueden usar diferentes técnicas, como diluciones seriadas que inducen la alteración de la membrana permitiendo la entrada de material genético exógeno. Esta recombinación genética que ocurre en la transformación bacteriana trae consigo grandes ventajas evolutivas que permiten al organismo ciertas adaptaciones al medio.

Introducción

La transformación bacteriana es un proceso por el cual una bacteria introduce DNA exógeno que se encuentra libre en el medio, este material genético circular es conocido como plásmido; una vez que el plásmido entra se vuelve parte del material genético de la bacteria, el cual puede ser heredado a nuevas células. Para que ocurra la introducción de este material a la célula se pueden llevar a cabo diferentes procedimientos tanto naturales, en algunos casos, como artificiales donde la bacteria que se encuentra en estado competente permite la entrada de DNA ajeno, entre las técnicas aplicadas se encuentran las diluciones seriadas que alteran y distorsionan la pared celular.

La cepa DH5a, es una cepa de bacterias E. coli competentes, que presenta una alta eficacia de transformación de > 1 x 106 cfu/µg de ADN plasmídico, propiedad que la hace un buen objeto de estudio; se utiliza para técnicas de clonación y aislamiento de plásmido.  

Por otro lado la kanamicina fue descubierta en 1955 en el Instituto de Higiene de Tokio, este antibiótico bactericida es producido por Streptomyces Kanamyceticus con un amplio espectro contra diversos microorganismos gram positivos y gram negativos, se han observado que el sulfato de kanamicina inhibe la translocación y provoca errores de codificación interfiriendo en la síntesis proteica en las bacterias, por lo tanto las bacterias como E. coli presentan una alta sensibilidad a este antibiótico.

El fenómeno de recombinación genética ocurrido durante la transformación bacteriana puede generar muchas ventajas al microorganismo, pues permite al individuo generar alguna nueva función que puede dar como resultado una adaptación a los cambios del medio ambiente; asi las bacterias pueden desarrollar resistencia ante condiciones adversas.

Palabras clave

Bacterias competentes, recombinación genética, plásmido, Kanamicina. 

Hipótesis

Si se introduce el plásmido pENTER en las bacterias de la cepa DH5a E. coli se observara un crecimiento bacteriano en medio LB con Kanamicina.  

Objetivo

Observar la resistencia de bacterias de la cepa DH5a al antibiótico de Kanamicina a través de la transformación bacteriana con el plásmido pENTER en diferentes cantidades evaluando su eficiencia.  

Material y método

Inicialmente se colocó en 3 tubos eppendorf 50μl de la cepa en cada uno. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas, se coloco 18μl de medio LB y 2μl de plásmido en un trozo de parafilm que corresponde a la primera dilución, de esta dilución se tomó 2 μl y se colocó en una segunda gota con 18 μl de medio LB, para la última dilución únicamente se utilizó 2 μl de plásmido sin ninguna cantidad de medio.

Para continuar con el procedimiento se marcaron los tubos eppendorf con las cepas bacterianas con 2, 20, 200 respectivamente; una vez hecho el marcaje se tomó 2μl de cada una de las diluciones realizadas, se colocó en los tubos eppendorf con bacterias y fueron incubados en hielo por 30 minutos. Una vez pasado el periodo de incubación en hielo se colocaron en un vaso de precipitado con agua a 42ºC por un minuto, se trasladaron a un recipiente con hielo donde permanecieron 3 minutos y posteriormente se le agrego 1μl de medio LB, los tubos fueron colocados en una incubadora durante 40 minutos aproximadamente. Pasado este periodo de tiempo, los tubos fueron colocados en una centrifuga con el objetivo de quitar el sobrenadante; se plaqueo en cajas de Petri grandes con medio LB y kanamicina, concentración 50μg/ml, con ayuda de un asa de vidrio fundida en el mechero. Las cajas de Petri permanecieron 23 horas aproximadamente bajo condiciones de laboratorio, después fueron revisadas y se realizó un conteo de colonias.  

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Resultados y discusión

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En la mayoría de los cultivos se observó un crecimiento de la cepa DH5a a pesar de la presencia de Kanamicina, lo cual indica que las bacterias lograron implementar el plásmido en su DNA; las bacterias de manera natural no son resistentes al antibiótico de Kanamicina, pero cuando se llevó a cabo la transformación con el plásmido pENTER los organismos fueron capaces de sobrevivir y reproducirse en un medio en presencia del antibiótico, así pues ocurrió una transformación bacteriana de las bacterias de la cepa DH5a que ahora son tolerantes ante la presencia del antibiótico Kanamicina.

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