Diagnostico diferencial en un solo paso para dengue y otras arbovirosis

Universidad Juárez del Estado de Durango

Escuela Superior de Biología

Diagnostico diferencial en un solo paso para dengue y otras arbovirosis

Anteproyecto de tesis que presenta

Daniel García Ruiz

Como requisito parcial para optar por el título profesional de

Biólogo

Gómez Palacio, Durango

Noviembre 2011

Universidad Juárez del Estado de Durango

Escuela Superior de Biología

Diagnostico diferencial en un solo paso para dengue y otras arbovirosis

Director interno:

MSP. Juan Carlos Herrera Salazar

Director externo:

Darwin Elizondo Quiroga Ph. D.

1. Introducción.

El término arbovirus se refiere a un grupo informal de virus los cuales son trasmitidos por un vector artrópodo. Entre los principales arbovirus que producen infecciones en humanos, y animales de importancia económica se encuentran miembros del complejo de virus del dengue, el complejo de encefalitis equina y el complejo de encefalitis japonesa (12). La mayoría de las infecciones por arbovirus producen un cuadro clínico con fiebre moderada a severa, y sintomatología similar al dengue. México es un área endémica del virus dengue además de que se ha reportado la presencia de otros arbovirus tales como virus del oeste de Nilo, virus de encefalitis equina venezolana y virus de san Louis (22).

El dengue es una enfermedad cuyo agente causal es el virus del mismo nombre, el cual cuenta con 4 serotipos, los cuales en nuestro país se encuentran distribuidos en la mayor parte del territorio nacional. Este virus es trasmitido principalmente por el mosquitos vector Aedes aegypti, pero para otras regiones del mundo también esta reportado A. albopictus, ambos se presentes en zonas urbanas (20).

El dengue es la enfermedad viral trasmitida por mosquito de más rápido crecimiento en las últimas décadas, además su incidencia se ha incrementado 30 veces en los últimos años. A nivel mundial se presentan 50 millones casos de esta enfermedad, siendo las zonas más afectadas, Asia y el pacifico, América y África. En México se presentan un promedio de 10,000 casos anualmente (1).

Parte de la carga atribuida al dengue, es en realidad generada por otras enfermedades, por ejemplo, se estima que en algunos países de Latinoamérica hasta el 10% de la carga atribuida directamente a este virus, es causada por el virus de encefalitis equina venezolana (11), aunque el porcentaje real producido por otros arbovirus u otras enfermedades se desconoce.

Debido a que distintos arbovirus generan un cuadro clínico similar, pueden presentarse diagnósticos imprecisos, por lo que es necesario desarrollar pruebas que nos permita el diagnostico diferencial entre el dengue y otros arbovirus.

El diagnóstico convencional para dengue es mediante la prueba MAC-ELISA en busca de anticuerpos IgM neutralizantes al virus, la cual está considerada como el estándar de oro, sin embargo los inconvenientes de esta prueba son que las concentraciones detectables de estos anticuerpos, comienzan a partir del quinto día posterior al inicio de la fiebre, además puede existir una reacción cruzada con anticuerpos neutralizantes de virus heterologos de la misma familia, resultando en falsos positivos.

Otro de los métodos diagnósticos utilizados en los últimos años para la detección de enfermedades, entre otros usos, es la PCR, la cual es una herramienta que nos permite la detección del virus en etapas tempranas de la enfermedad (a partir del primer día febril), por tanto que utilizando una de las últimas versiones de esta técnica (PCR en tiempo real) la cual requiere menos tiempo para el diagnóstico que la PCR punto final, y reduce el manejo de muestras, lo que disminuye el riesgo de contaminación, es que se propone el desarrollo de este proyecto.

2. Objetivos.

2.1 Objetivo General:

• Desarrollar una prueba para el diagnostico diferencial en un solo paso entre dengue y otros arbovirus, mediante PCR en tiempo real.

2.2 Objetivos Específicos:

• Diseñar cebadores universales para los 4 serotipos de dengue así como específicos para cada serotipo.

• Diseñar cebadores para el virus del oeste del Nilo, Virus de San Luis, encefalitis equina Venezolana, encefalitis Equina del este; y encefalitis equina del oeste.

• Construir un control positivo clonando un fragmento de la secuencia del virus del dengue.

• Construir un control positivo clonando un fragmento de la secuencia del virus del Oeste del Nilo.

• Determinar la presencia de otros arbovirus, circulantes en el estado de Jalisco.

3. Antecedentes.

3.1. Arbovirus

El termino arbovirus refiere a virus de ARN pequeños de entre 40nm a 120nm de diámetro, los cuales son trasmitidos por artrópodos; algunas de las familias de importancia clínica son Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae y Reoviridae. En la mayoría de los casos, los arbovirus producen infecciones asintomáticas, sin embargo las infecciones sintomáticas generalmente producen uno de tres síndromes: fiebre auto limitante con sintomatología parecida a dengue, fiebre hemorrágica, o enfermedad del sistema nervioso central (12).

3.2. Flavivirus

El genoma de los virus pertenecientes a esta familia, es una molécula de ARN de cadena sencilla en sentido positivo(8), de alrededor de11,000 nt, con un solo marco abierto de lectura que se traduce en una poliproteína, que es cortada en 10 proteínas maduras; la región 5' del genoma codifica para 3 proteínas estructurales, cápside (C), pre membrana (pre-M), y envoltura (E), mientras que la región 3' del genoma codifica para 7 proteínas no estructurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 (9). Para completar la replicación, el virus requiere la circularizacíon del genoma mediante interacciones entre las regiones 5'UTR y 3'UTR (10)

3.2.1. Dengue

El virus del dengue (VDEN) es un flavivirus compuesto de una sola cadena de ARN, que comprende cuatro serotipos distintos (DEN1-4), pertenecientes al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae. Las infecciones sintomáticas de esta enfermedad se clasifican en tres categorías: fiebre indiferenciada, fiebre de dengue, y fiebre hemorrágica, donde esta última se sub clasifica de acuerdo a su severidad en cuatro tipos, siendo los tipos III y IV los que se definen como síndrome de choque (1).

En el mundo se presentan 50 millones de casos de dengue anualmente (1); así mismo en México tan solo en un periodo de cinco años (2000 y el 2005) se presentaron un total de 61 814 casos de dengue, donde 7,139 presentaron fiebre hemorrágica, o síndrome de choque, y 26 resultaron en muerte (4).

3.1.2. Virus del oeste del Nilo

La fiebre del Oeste del Nilo fue identificada por primera vez en el distrito de West Nile en Uganda en 1937 (7); el agente etiológico es el virus del oeste del Nilo (VON) perteneciente a la familia flaviviridae formando parte del serocomplejo de la encefalitis japonesa. El virus es mantenido en la naturaleza en un ciclo enzoótico ave-mosquito-ave siendo el vector principal de la enfermedad el mosquito Culex quinquefasciatus, aunque otros mosquitos del mismo genero han sido identificados como vectores. Las aves son el amplificador del virus, y los seres humanos y equinos, son hospederos incidentales, los cuales no alcanzan una concentración del virus en sangre periférica, suficiente para infectar a otros mosquitos (15). Se demostrado su presencia en México, Colombia, Islas Caimán, Jamaica, Puerto Rico, el Salvador, Martinica y Guadalupe entre otros países (6). Las infecciones sintomáticas en su mayoría presentan un cuadro febril auto limitante, de moderada intensidad, y aproximadamente el 1% de los individuos infectados desarrollan infección y enfermedad neuronal (15).

Desde la aparición del primer caso en Estados Unidos en 1999 se han reportado infecciones todos los años con una incidencia máxima de 9862 casos en 2003 para este país. En el 2011 se reportaron 712 casos, donde los estados con mayor incidencia fueron Arizona y Nuevo México (21).

3.1.3. Virus de San Luis.

La encefalitis de san Luis es una arbovirosis emergente en América latina, causada por el virus homónimo el cual pertenece a la familia flaviviridae con el genero flavivirus (14); así mismo forma parte del serocomplejo de la encefalitis japonesa. Su ciclo de transmisión esta dado entre mosquitos del genero Culex sp. y aves del orden paseriforme. La enfermedad causada por este virus puede variar en su sintomatología desde síntomas moderados como fiebre y dolor de cabeza, a una sintomatología más severa tornándose en meningitis y encefalitis (16).

En Estados unidos en 1975 fue el año que se presento el mayor número de casos de esta enfermedad, con un total de 1967 casos confirmados, sin embargo a través de los años este número ha disminuido considerablemente

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