Azucares Reductores

INTRODUCCION

Como ingenieros agroindustriales llegamos a enfrentarnos con el montaje de técnicas que nos permitan analizar las muestras resultantes de los experimentos que realizamos, y poder así generar las conclusiones adecuadas a ese respecto. Una de las técnicas analíticas que aprendemos desde que estamos estudiando es la desarrollada por Miller (1959). Este método se selecciona por ser rápido y reproducible, además sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación, para cuantificar los productos de una reacción enzimática, reduciendo así el acido 3,5-dinitrosalisilico (el cual se encuentra de color amarillo naranja) por la glucosa y/o fructosa el acido 3-amino-5-nitrisalisilico (de color rojo obscuro), cuya presencia puede detectarse por la lectura de la absorbancia obteniendo así la concentración a partir de la recta que se hace al realizar la curva de calibración, que correlaciona la Absorbancia medida a 540 nm con la concentración de Glucosa[1].

Este solución DNS está compuesta por 5g de hidróxido de sodio; 5g de acido 3,5-dinitrosalisilico; 2.5g de bisulfito de sodio y 1g de fenol en cristales completando a 500ml de agua y evitando su exposición a la luz.

Con el paso del tiempo y el vertiginoso desarrollo de la tecnología, después de casi 50años, esta técnica a sufrido algunas modificaciones, sin embargo, en esencial sigue siendo lo mismo. Cada laboratorio que la emplea debe respetar la composición del reactivo DNS aunque puede modificar las cantidades de reactivo y de muestra que empleara. Es importante recordar que siempre que ágamos una modificación debemos comprobar que no se está afectado la linealidad del método [2]. Hay que tener en cuenta que este es un método relativamente barato, aunque su especificidad es baja. Cuando los efectos de compuestos extraños no son conocidos, uno puede incluir efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azúcar se adiciona a esta muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es equivalente a la cantidad incrementada de azúcar [3].

Cuando se usan métodos químicos el más aconsejable es el que utiliza el reactivos de Fehling-Soxhlet, que precipita el oxido cuproso (Cu2O) en presencia de una sustancia reductora. El método puede ser volumétrico o gravimétrico. Otro método usado para la determinación de azucares reductores es el método gravimétrico corresponde a la cantidad de cobre reducido en presencia de azúcares reductores; el peso en miligramos de Cu2O corresponden a los miligramos de azúcares analizados, por medio de las tablas de Munson y Walker que aparecen en el AOAC. (Hay que tener en cuenta las diluciones para reportar la concentración final) [4].

MATERIALES Y MÉTODOS.

Preparación de la solución estándar de glucosa anhidra.

Para la preparación de la solución estándar se pesó 0.1g de glucosa anhidra en una balanza analítica, para disolverla en 100ml de agua destilada en un matraz aforado de 100ml. La solución se agitó fuertemente y se adicionó un pequeño volumen de esta en un beaker de 100ml, descartando el sobrante de la solución en el matraz, ya que solo se empleó el volumen extraído en el beaker.

Preparación de las muestras a partir de la solución estándar de glucosa anhidra.

Se extrajo de la solución estándar con la pipeta de 1ml los volúmenes de las 6 muestras a preparar, adicionando estos en tubos de ensayo. Las muestras con sus respectivas concentraciones se aprecian en la siguiente tabla.

Las nuevas soluciones en los tubos de ensayo se agitaron y dejaron en reposo en la gradilla.

Adición del reactivo DNS.

Del reactivo DNS en el envase original, se depositó un pequeño volumen, en un beaker de 100ml; esto con la finalidad de evitar contaminar el reactivo, con la precaución de emplear guantes de látex debido a los efectos tóxicos, cancerígenos, abortivos que posee.

Seguido a cada tubo de ensayo con la solución estándar correspondiente se adicionó 1ml de dicho reactivo con el pipeteador automático (pipeta 10ml) para facilitar el procedimiento; luego se agitó los tubos de ensayo en el vortex y se introdujeron en un baño de maría (beaker de 500ml) previamente montado, durante 5 minutos.

Fijación del reactivo DNS en la solución estándar.

Finalizado el proceso de ebullición, se enfriaron los tubos de ensayo en un baño de hielo previamente preparado en un beaker de 500ml. Seguido, a cada tubo se agregó 8ml de agua destilada con la pipeta de 10ml y se agitaron fuertemente en el vortex.

Medición de absorbancia en el espectrofotómetro.

De cada muestra en los tubos de ensayo se tomó una pequeña fracción para adicionarla en

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