Crecimiento folicular en ovarios bovino y desarrollo correlacionado con la expresión de ácido lipofosfatídico

Crecimiento folicular en ovarios bovino y desarrollo correlacionado con la expresión de ácido lipofosfatídico

Resumen.

La base de la una reproducción exitosa es un crecimiento folicular apropiado. Además de la presencia de prostaglandinas y del factor de crecimiento endotelio vascular, se sugieren varios factores nuevos como importantes reguladores del desarrollo y crecimiento folicular: PGES, TGF, CD36, RABGAP1, DBI, y BTC.

Este estudio se enfoca en examinar esos factores en las células de la granulosa y de la teca que se originan de diferentes tipos de  folículos ováricos y su vínculo con la expresión de ácido lipofosfatídico (LPA), conocido regulador local de las funciones reproductivas en la vaca.

Los folículos ováricos fueron divididos en sanos, transicionales y atrésicos. Los niveles de expresión del mRNA de la PGES, TFG, CD36, RABGAP1, DBI y BTC en las células de la granulosa y de la teca en diferentes folículos ováricos fueron medidos mediante PCR en tiempo real. Las correlaciones entre la expresión de enzimas sintetizadoras de LPA, receptores de LPA y factores examinados fueron medidos. La inmunolocalización de PGES, TFG, CD36, RABGAP1, DBI Y BTC fueron examinados por inmunohistoquímica.

Investigamos la expresión de mRNA dependiente de los factores potencialmente involucrados en el desarrollo y crecimiento folicular ovárico, ambos en las células de la granulosa y de la teca en folículos ováricos bovinos. Fuertes correlaciones entre los receptores de LPA, enzimas sintetizadoras de LPA y los factores examinados en folículos transicionales y sanos fueron observadas con una fuerte intercomunicación con TFG, DBI y RABGAP1 en las células dela granulosa y TFG en la células de la teca; mientras que en folículos atrésicos no fueron detectadas. Un gran número de correlaciones fueron encontradas en las células de la teca en comparación a las células de la granulosa, así como en los folículos sanos y folículos transicionales fueron observadas. Esta información indica el papel del LPA en el crecimiento, desarrollo y fisiología del folículo ovárico bovino.

1. introducción

El folículo preovulatorio es considerado la unidad limitante del ovario en la reproducción exitosa. El papel principal del folículo preovulatorio es proveer al oocito de las condiciones apropiadas para su desarrollo y crecimiento. Basado en la relación Estradiol: Progesterona (E2:P4), los folículos ováricos pueden dividirse en tres grupos: Sanos, transicionales  y atrésicos. El folículo ovárico incluye dos tipos principales de células, de la granulosa y de la teca, las cuales son responsables de nutrir a los oocitos hasta la ovulación y liberación de oocitos maduros con la capacidad de producir un embrión. La apropiada diferenciación de las células de la teca y granulosa es requeridas para el apropiado desarrollo de folicular y el proceso de ovulación. Entre varios factores regulando estos procesos en varias especies son las prostaglandinas, factor de crecimiento endotelio vascular, y un número de factores con funciones conocidas que son importantes para el desarrollo folicular y ovulación: prostaglandina E sintasa (PGES) TRK-Fused gen TFG, receptor a trombospondina (CD36), proteína activadora de GTPasa en conejo 1(RABGAP1), molécula inhibidora a la unión a diazepam y la betacelulina (BTC). La prostaglandina E sintasa en una de las enzimas que metabolizan el ácido araquidónico y es crucial en el proceso ovulatorio en ganado. El  TRK-Fused gen fue originalmente identificado como parte de los genes de fusión oncogénica involucrados en la promoción de tamaño del CCO en ratón. El receptor a trombospondina es un factor de crecimiento autocrino que puede regular el crecimiento celular, adhesión y angiogénesis. La proteína activadora de GTPasa de conejo 1 es una nueva GTPasa que puede tener función en el ovario. Presente en  el ovario de rata, la DBI estimula la estereoideogenesis y la biosíntesis de pregnenolona. La betacelulina es uno de los miembros de la familia de factores de crecimiento similares a EGF, los cuales son importantes mediadores de la actividad de la hormona luteinizante. La expresión de os factores antes mencionados en diferentes tipos de folículos ováricos bovinos y su potencial rol en la foliculogénesis y ovulación no ha sido estudiada anteriormente.

Entre los factores locales regulando la función reproductiva femenina está el ácido lipofosfatídico. El ácido lipofosfatídico (LPA) es un fosfolípido que promueve las acciones biológicas tales como tales como la proliferación celular y su diferenciación e interacciones célula- célula. En mamíferos, el LPA induce su actividad por la bien conocida y bien estudiada vía GPRC de tipo: LPAR1/EDG2, LPAR2/EDG4, LPAR3/EDG7 y LPAR4/P2Y9. El LPA es producido por dos enzimas principales, la fosfolipasa A2 (PLA2) y autotaxina (AX). El rol de la LPA en el sistema reproductor ha sido estudiado en ratonas, cerdas, cabras y vacas. En el tracto reproductivo bovino, el LPA es sintetizado en el endometrio, oviducto, cuerpo lúteo y el embrión. Además, estudios recientes han demostrado la dependencia del tipo de folículo de LPA en componentes del folículo ovárico bovino - células de teca y granulosa.

El objetivo de este estudio fue investigar la expresión de factores que están potencialmente involucrados en el crecimiento y desarrollo del folículo ovárico y en la ovulación en las células tecales y de la granulosa que se originan en diferentes tipos de folículos ováricos. También examinamos el posible vínculo entre los factores antes mencionados, LPA síntesis y la expresión de los receptores de LPA en tres diferentes tipos de folículos ováricos.

2. Material y métodos

2.1. Colección ovárica

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Local de Cuidado y Uso de Animales en Olsztyn, Polonia (Acuerdo No. 34 /2012 / N). Los ovarios, independientemente de la etapa del ciclo estral, se recogieron de vacas maduras en un matadero local y se transportaron al laboratorio en 40 minutos en solución salina tamponada con fosfato estéril (tampón PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2KPO4 10 mM, 1,8) KH2PO4 mM, pH ¼ 7,4), complementado con gentamicina al 0,4% (Sigma # G-1397)).

2.2. Colección del material experimental

En el líquido folicular aspirado de los folículos ováricos antrales (diámetro <5 mm), los niveles de E2 y P4 se midieron mediante el método RIA (el kit DIAsource E2eRIAeCT, KIP0629, DIAsource y el kit DIAsource PROGeRIAeCT, KIP1458, DIAsource, respectivamente). Según la relación intrafolicular E2: P4 (según Irlanda e Irlanda 1994), los folículos ováricos se dividieron en tres grupos: sano (E2: P4> 1), transicional (0,01

2.3. Extracción total de ARN, transcripción reversa (RT) y PCR en tiempo real

La capa de teca se homogeneizó antes de la extracción de ARN. El ARN total se extrajo de acuerdo con el protocolo del kit de aislamiento Total RNA Mini (A & A Biotechnology, # 031e100). Las muestras de ARN se almacenaron a -80°C. Antes del uso, el contenido y la calidad del ARN se evaluaron mediante medición espectrofotométrica. La cantidad de 500 ng de cada muestra de ARN total se transcribió de forma inversa (de acuerdo con el kit de síntesis de cDNA de First Strand para el protocolo RT-qPCR, Thermo Scientific, n. º K1642). La expresión de ARNm para las enzimas responsables de la síntesis de LPA (fosfolipasa A2ePLA2 y autotaxineAX), los receptores para LPA (LPAR1, LPAR2, LPAR3 y LPAR4) y los factores de importancia potencial para el proceso ovulatorio y el desarrollo del folículo preovulatorio (PGES, DBI, CD36, TFG, RABGAP1 y BTC) se midieron mediante PCR en tiempo real usando sondas TaqMan específicas.

La PCR en tiempo real se realizó con un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Life Technologies, EE. UU.) Usando la mezcla maestra de qPCR Maxima Probe / ROX (nº K0231, Thermo Scientific, EE. UU.). Las reacciones de PCR se realizaron en placas de 384 pocillos. Los resultados de la transcripción de ARNm se normalizaron a niveles de ARNm de beta-actina (ACTB, un control interno) y se expresaron como unidades arbitrarias. El gen de limpieza fue elegido utilizando el software NormFinder mediante la comparación de los siguientes dos genes candidatos: GAPDH y ACTB [32]. Los cebadores se diseñaron utilizando un paquete de software en línea (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Las secuencias de los cebadores y los tamaños de los fragmentos amplificados de todos los transcritos se muestran en la Tabla 1. Para la cuantificación relativa de los niveles de ARNm, se usó el software Miner (http://miner.ewindup.info).

2.4. Inmunohistoquímica

Para inmunolocalizar los factores implicados en el proceso de ovulación y el desarrollo folicular en el folículo ovárico bovino, los ovarios con folículos antrales se fijaron en formaldehído tamponado al 4% para inmunohistoquímica (según [33]). Las proteínas de interés se tiñeron con el uso de anticuerpos policlonales de cabra: anti-BTC, anti-DBI, anti-CD36 (dilución para todos los anticuerpos 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, # sc-5800, # sc-23474, #sc -5522, respectivamente), anti-PGES (dilución 1:50, Santa Cruz Biotechnology, # sc-32589), anti-TFG (dilución 1: 150, Abcam, # ab72126) y anti RABGAP1 (dilución 1: 200, Abcam, # ab153992). Las secciones de control negativo se incubaron con IgG irrelevante de cabra (concentración 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, # sc-2028).

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