EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE GLUTATIÓN

Tema: “EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE GLUTATIÓN”

INTRODUCCIÓN

La fase oxidativa de la vía de las pentosas fosfato permite la oxidación de la glucosa 6 fosfato a pentosas fosfato y la generación de NADPH utilizado por las células para la biosíntesis reductiva, la reducción de la forma oxidada del glutatión (GSSG) a la forma reducida correspondiente (GSH) o para contrarrestar los efectos nocivos de los radicales libres del oxígeno en los eritrocitos y las células del cristalino y de la córnea que están directamente expuestos al oxígeno y a los radicales libres y peróxidos. Al mantener una atmósfera reductora mediante una alta relación de NADPH a NADP y de glutatión reducido a glutatión oxidado se puede evitar o atenuar el daño a proteínas, lípidos, ADN y otras moléculas sensibles.

El glutatión (GSH) es un tripéptido formado por residuos de ácido glutámico (Glu), cisteína (Cys) y glicina (Gly). Se encuentra fundamentalmente en los órganos celulares y en los glóbulos rojos. En los tejidos y células del organismo animal, el glutatión se encuentra en forma reducida (GSH) y en forma oxidada como hexapéptido GSSG. Entre las numerosas funciones biológicas en las que está implicado, podemos destacar la eliminación de radicales libres y la formación de conjugados para la excreción de tóxicos celulares.

Los grupos tiol (SH) son agentes reductores. El GSH reduce los enlaces disulfuro formados en las proteínas citoplasmáticas a Cys. En el proceso el GSH es convertido a su forma oxidada el disulfuro de glutatión (GSSG). El GSH se encuentra casi exclusivamente en su forma reducida, puesto que la enzima que lo revierte, la glutatión reductasa, es constitutivamente activa e inducible cuando existe estrés oxidativo. El glutatión es indudablemente el más importante de los antioxidantes, al punto que sin él los seres humanos, animales y plantas morirían. El rol principal de este péptido pequeño es el de proteger a los millones de células de los seres vivos.

Para la determinación cualitativa del GSH, se realiza la reducción del GSSG mediante la reacción con el sulfuro sódico que se desprende en medio alcalino y que al combinarse con nitroprusiato sódico forma un compuesto de color carmesí. Debido a la no disponibilidad de nitroprusiato la identificación del GSH se realizará mediante una técnica de identificación de S en muestras orgánicas.

PROCEDIMIENTO

Extracción de GSH a partir de sangre

Separación de eritrocitos: colectar 5 ml de sangre en un tubo con EDTA (disponible en locales de venta de materiales para laboratorios clínicos). Centrifugar las muestras a 5000 g por 5 min. Remover cuidadosamente el sobrenadante, extraer una alícuota de 100 µl de los eritrocitos empacados y añadir a 9,9 ml de tampón fosfato 0,01M de pH 7,5 que contiene 0,005 M de EDTA para producir un hemolizado. Comprobar la presencia del GSH a través de la detección de S.

Identificación del glutatión en forma de sulfuro:

En un tubo de ensayo coloque 2 ml del sobrenadante de la extracción de GSH (solución de eritrocitos hemolizados), agregue 2 ml de la solución de NaOH al 10% y caliente, a continuación

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