Antecedentes nitrato reductasa

La participación de formiato deshidrogenasas distintos componentes y citocromo en la reducción del nitrato por Escherichia coli fue estudiada. La actividad formiato deshidrogenasa presente en los extractos preparados a partir de células inducida por nitrato de HfrH cepa fue activo  con varios aceptores de electrones, incluyendo el azul de metileno, metosulfato de fenazina, y viológeno bencilo. Ciertos mutantes que no son capaces de reducir el nitrato tenía niveles bajos o indetectables de actividad formiato deshidrogenasa ensayadas con metileno azul o metosulfato de fenazina como aceptor de electrones. De nueve de estos mutantes, cinco gas producido cuando se cultiva en condiciones anaeróbicas sin nitrato y poseía un bencilo viológeno ligada actividad formiato deshidrogenasa, lo que sugiere que formiato deshidrogenasas distintas participar en la nitrato reductasa y sistemas hydrogenlyase fórmico.

Los otros cuatro mutantes formadas poco gas cuando crecido anaeróbicamente en ausencia de nitrato y carecía de la bencilo viológeno ligado formiato deshidrogenasa, así como la azul de metileno o fenazina metosulfato actividad ligada. El citocromo b1 presente en las células inducida por nitrato se distinguió por sus propiedades espectrales y su genética el control de los principales componentes b1 citocromo de las células aeróbicas y de las células cultivadas anaeróbicamente en ausencia de nitrato. El b1 citocromo-nitrato específica era completamente y rápidamente reducido por 1 mm formiato pero no se redujo en un reducido 1 mM nicotinamida adenina dinucleótida; ascorbato reduce sólo parte de la citocromo b1 que se redujo por formiato. Cuando se añadió nitrato, el formiato-reducido b1 citocromo se oxidó con cinética bifásica, pero el citocromo reducido ascorbato-bk se oxida con una cinética monofásicas. Los efectos inhibidores de n-heptilo hidroxiquinolina-N-óxido en la oxidación de b1 citocromo por nitrato proporcionado evidencia de que el citocromo-nitrato específica se compone de dos componentes que tener diferentes potenciales redox pero las propiedades espectrales idénticas. Llegamos a la conclusión de estos estudios que la reducción de nitrato en E. coli está mediada por la operación secuencial de un formiato deshidrogenasa específica, dos específica del citocromo b, componentes, y nitrato reductasa.

Una serie de observaciones indican que el nitrato reducción en Escherichia coli se produce principalmente por un vía que implica formiato deshidrogenasa, citocromo b1, y nitrato reductasa. Entre el diversos sustratos que son metabolizados por E. coli, formiato es el electrón donante más eficaz para la reducción de nitrato en las células cultivadas anaeróbicamente en presencia de nitrato (2, 23).

En tales células, formiato deshidrogenasa, citocromo b1, y nitrato reductasa son inducidos a relativamente altos niveles en comparación con los de las células crecido en ausencia de nitrato (2, 17, 23). Estos tres componentes están presentes en fracciones de la membrana (6) y han sido parcialmente purificado como una unidad a partir de extractos de células (8). Por último, los mutantes de E. coli que son incapaces de producir nitrito a partir de nitrato (mutantes NR) carecen de cualquiera de formiato reductasa o combinaciones de deshidrogenasa o nitrato de estas actividades y citocromo b1 (1, 16,17, 22).

La propuesta que el formiato deshidrogenasa y b1 citocromo son componentes específicos del sistema de reducción de nitratos, plantea algunas importantes cuestiones relativas a la relación de este vía con otras vías de transporte de electrones en E. coli. Formiato deshidrogenasa obligada también puede ser un componente del sistema hidrogenasa (15), así como de formiato oxidasa. Estas funciones múltiples de la formiato deshidrogenasa han sido reconocidos previamente, y ha sido sugerido que al menos dos distintos formiato deshidrogenasas, partículas y solubles, son formado por E. coli (4, 5).

La participación de citocromo b1, en nitrato reducción crea una situación aún más compleja, desde b1 citocromo es uno de los principales citocromos presentes tanto en aeróbico y anaeróbico células de E. coli y por lo tanto debe funcionar en otros sistemas de transporte de electrones (3, 10, 18). A la actualidad no se sabe si los distintos componentes del citocromo b1 están involucrados en diferentes vías de electrones o en qué grado de tales vías interactua.

Para definir los componentes del complejo nitrato reductasa y su relación con las otra vías metabólicas, se estudió la bioquímica eventos involucrados en la reducción del nitrato en el tipo salvaje E. coli y en un número de mutantes NR.

Se presenta evidencia de un específico formiato deshidrogenasa, dos difetentes componentes de citocromos b1, y nitrato reductasa son componentes obligatorios de un complejo de nitrato reductasa en E. coli.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las cepas de E. coli utilizadas en estos estudios, HfrH y AB2102, y los mutantes NR- derivan de ellos se ha descrito previamente (17). Se cultivaron todas las cepas en un medio completo que contiene una base de sal (20), clorhidrato de tiamina (5, g / MI), 0,4% de nutrientes-broth (Difco), y 1% de glucosa (esterilizada por separado). Cuando se indica, el medio fue suplementado con 1% de nitrato de potasio y formiato de sodio 0,5%.

RESULTADOS

Las propiedades generales de la reducción de nitrato presente en las cepas de tipo silvestre utilizados en estos estudios correspondieron a los anteriormente informaron (2, 6, 8). En las células inducida por nitrato de cepas HfrH, formiato era una más eficaz donador de electrones para la reducción de nitrato que la glucosa (Tabla 1). En las células congelado-descongelado o en extractos de células, varios reactivos actúan como donadores de electrones para la reducción de nitrato (Tabla 1). La reducción del metil- viológeno, que transfiere electrones directamente a nitrato reductasa fue el más efectivo donante de electrones, pero formiato era de 30 a 40% como activo como reducida viológeno de metilo en células c- d Reducción de nitratos con formiato como donador de electrones se inhibió completamente por mM n-heptilo hidroxiquinolina-N-óxido de 0,01 (HOQNO), mientras que un aumento de 100 veces en el concentración del inhibidor no afectó a la reducción de nitrato con reducida metilviológeno o ascorbato como el donador de electrones.

La formiato deshidrogenasa presente en células  inducidad de nitrato de la cepa HfrH utilizan varios aceptores de electrones (Tabla 2). Azul de metileno y Fenazina metosulfato fueron los más eficaces Aceptoras, mientras que el ferricianuro de potasio, Viologeno y cloruro de trifeniltetrazolio Mucho menos eficaz. Hemos medido rutinariamente Formiato deshidrogenasa siguiendo la reducción De diclorofenol indofenol (DCPIP) En presencia de cantidades catalíticas de fenazina Metosulfato (17). Aunque DCPIP es sólo Reducido lentamente por una mezcla de extracto crudo  Y formiato , en presencia de pequeñas cantidades De fenazina metosulfato se reduce a una velocidad Que corresponde a la tasa observada con azul de metileno. Este ensayo no Flujo indirecto de electrones a través del citocromo B1, ya que el citocromo bi no está oxidado Por fenazina metosulfato en nuestras preparaciones Y formiato deshidrogenasa puede ser ensayado por Este procedimiento en mutantes que carecen de citocromo b1.

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