COLIFORMES TERMOTOLERANTES

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PRÁCTICA Nª 07

RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES EN AGUAS RESIDUALES

1. INTRODUCCIÓN.

El crecimiento de la población a nivel mundial y el aumento del uso del agua para diferentes actividades, ha incrementado los niveles de contaminación. Esta contaminación está relacionada con los vertidos de origen doméstico e industrial a los cuerpos de agua. En el caso de los residuos de origen doméstico, la carga contaminante está representada por altos porcentajes de materia orgánica y microorganismos de origen fecal.(Delgado, 2015)

Dentro de los microorganismos patógenos se encuentran el grupo de bacterias coliformes el cual está conformado por dos subgrupos: los coliformes totales y los termotolerantes. A estos últimos antes se los denominaba coliformes fecales. El cambio de nombre se debe a que se demostró que en el grupo de coliformes que se detectaban en siembras incubadas a temperaturas de 44,5 °C y en medios de cultivo específicos, sólo una parte del grupo eran bacterias de origen fecal; el resto eran bacterias ambientales.(Delgado, 2015)

En el grupo de bacterias termotolerantes está incluida la Escherichia coli, considerada como un organismo indicador de contaminación fecal. Se ha demostrado que esta bacteria siempre está presente en un número elevado en las heces de humanos y animales de sangre caliente y comprende casi 95% de los coliformes en las heces.(Delgado, 2015)

Por esta razón, la contaminación de origen fecal puede ser evaluada mediante la determinación de coliformes termotolerantes o mediante la presencia de E. coli. Estos microorganismos son causantes de enfermedades de origen hídrico, que generan altos porcentajes de morbi-mortalidad en la población. El control de la calidad de agua requiere una serie de análisis dirigidos a determinar la presencia de microorganismos patógenos.(Delgado, 2015)

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.

 Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. (UNAM, 2006)

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.(UNAM, 2006)

De la misma manera para identificar cuantitativamente la cantidad de coliformes presentes se emplea la técnica por estría la cual consiste en la llama de un mechero se utiliza para esterilizar. Cada vez que un matraz o un tubo de ensayo se abre para añadir o sacar material, se pasa la boca del mismo a través de la llama de un mechero, a fin de destruir cualquier microorganismo que pueda haberse depositado allí. Este procedimiento disminuye la probabilidad de que las células microbianas caigan en el recipiente y contaminen su contenido. Las asas e hilos de siembra, que los microbiólogos utilizan para tomar microorganismos de un medio y llevarlos a otro, también se esterilizan flameándolos en la llama de un mechero Bunsen hasta la incandescencia. Este método de esterilización es rápido y cómodo, pero peligroso cuando se trabaja con microorganismos causantes de enfermedad. (USAL , s.f.)

1. OBJETIVOS.

• Comparar la cantidad de coliformes termotolerantes hallados en las muestras de agua residual tomadas de las plantas de tratamiento de Las Delicias, Covicorti y el Milagro.
• Realizar la coloración Gram.
• Determinar qué tipo de coloración gran poseen las bacterias presentes en las muestras tomadas.

1. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.

1. Materiales:

• Algodón
• Asa bacteriológica
• Fósforo
• Marcador
• Mechero
• Micropipeta
• Papel craft
• Placas petri
• Tubos de ensayo

1. Equipos:

• Autoclave
• Cocina
• Estufa esterilizador
• Estufa incubadora
• Microscopio

1. Medios de Cultivo:

• Agar MacConkey (técnica por estría)
• EC Broth

1. PROCEDIMIENTO.

1. Preparación de medios de cultivos

• Preparación del medio Ec Broth.
• Preparación del medio MacConkey.

1. Preparación de la muestra (Dilución  )[pic 8]

• Esterilizar el envase en el cual se procederá a tomar la muestra.

• Recolectar 600 ml de agua residual de una laguna oxidación.
• Diluir la muestra original en tubos de ensayos.
• Colocar 1 ml de muestra en 1  de ensayo con 9ml de agua destilada.[pic 9]
• Agitar el , extraer 1ml de este y colocarlo en otro tubo, .[pic 10][pic 11]
• Proceder hacer lo mismo con los demás tubos.
• Incubación 44.5ºC x 24h.

1. Siembra (Siembra por estría en medio MacConkey)

• Extraer una gota del tubo  con la asa de siembra, por tener mayor concentración de gas.[pic 12]
• Proceder agregarla en la placa Petri con medio MacConkey, previamente servido.

1. Incubación de medios de cultivos

• Colocar los tubos en la incubadora 44,5ºC x 24h.

• Colocar las placas Petri en la incubadora 35ºC x 48h.

1. Interpretación de resultados

• Comenzar con la lectura de los tubos positivos (presencia de gas) y negativos (sin gas).

1. ESQUEMA

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1. RESULTADOS.

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