Coliformes NMP

Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (Número más Probable o NMP).

1. OBJETIVOS

- Conocer y aprender la técnica de NMP.

- Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli y enterococos.

- Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.

- Utilizar los métodos rápidos Enteroler y Colilert.

-

1.1 MATERIAL Y EQUIPO

- Mechero,

- Pro pipeta.

- Gradilla.

- Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)

- Lentes de seguridad

- Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodón

- Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodón

- Pipetas Pasteur estériles

- Asa bacteriológica

- Incubadora a 35° ± 2,0ºC.

1.2 INTRODUCCION

El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas potables.

Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli.

FUNDAMENTO

NMP (Numero más probable)

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.

- En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono.

- Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5± 0.1C por un periodo de 24 a 48 h.

Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

Colilert

Colilert usa la tecnología de sustrato definido Defined Substrate Technology® (DST®) patentada para detectar de forma simultánea los coliformes totales y E. coli. Dos nutrientes indicadores, ONPG y MUG, son las principales fuentes de carbono en Colilert y pueden ser metabolizados por la enzima coliforme β-galactosidasa y la enzima β-glucuronidasa de E. coli, respectivamente.

A medida que van multiplicándose los coliformes en Colilert, usan β-galactosidasa para metabolizar ONPG y cambiarla de incolora a color amarillo.

E. coli usa la β-glucuronidasa para metabolizar MUG y crear fluorescencia. Puesto que la mayoría de organismos no coliformes carece de estas enzimas, son incapaces de multiplicarse e interferir en este proceso.

Los escasos no coliformes que contienen estas enzimas se eliminan de manera selectiva gracias a la formulación especial de la matriz Colilert.

Este enfoque difiere del de los medios tradicionales, que ofrecen un entorno rico en nutrientes que impulsa la proliferación de organismos, independientemente de que sean objetivo o no. Cuando estos últimos se multiplican e imitan a los organismos objetivo, se producen resultados positivos falsos. La multiplicación de organismos no objetivo también puede suprimir a los organismos objetivos y producir resultados negativos falsos en los medios habituales. Para suprimir los organismos no objetivos, los medios tradicionales suelen incluir concentraciones elevadas de sales, detergentes u otros agentes selectivos que podrían, sin querer, eliminar organismos objetivos y obtener más resultados negativos falsos.

Enterolert

El método Enterolert emplea un indicador nutriente que emite fluorescencia cuando es metabolizado por las bacterias del grupo enterococo. La tecnología del sustrato definido evita la necesidad de utilizar azida de sodio, común en los métodos tradicionales. El sustrato cromogénico tal como el orto-nitrofenil- b -D galactopiranósido (ONPG) u otro equivalente, es empleado para detectar la enzima b -glucosidasa, la cual es producida por bacterias el grupo Enterococo. La enzima b -glucosidasa hidroliza al sustrato y provoca un cambio de color, el cual indica y sustenta una prueba positiva después de 24 horas sin procedimientos adicionales.

En lo que se refiere a Enterococos, un sustrato fluorogénico como el 4-metilumbeliferil- b --D-glucorónido (MUG) es utilizado para detectar la enzima b -glucosidasa. La enzima b -glucosidasa hidroliza el sustrato, produciendo fluorescencia cuando el líquido es expuesto a la luz ultravioleta de onda larga (365 nm)

1.3 Diagrama:

CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio

INOCULO (mL) CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL) VOLUMEN DE MEDIO MAS INOCULO (mL) CALDO LAURIL TRIPTOSA REQUERIDO g/L CONCENTRACIÓN

1 10 o más 11 o más 35,6 1 X

10 10 20 71,2 2 X

10 20 30 53,4 1.5 X

20 10 30 106,8 3 X

100 50 150 106,8 3 X

100 35 135 124.6 3.5 X

100 20 120 142.4 4 X

TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.

95% de Límite de Confianza (aproximado)

No. de Tubos Positivos NMP/100 mL Inferior Superior

0 <1,1 0 3,0

1 1,1 0,05 6,3

2 2,6 0,3 9,6

3 4,6 0,8 14,7

4 8,0 1,7 26,4

5 >8,0 4,0 Infinito

TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.

95% de Límite de Confianza (aproximado)

No. de Tubos Positivos NMP/100 mL Inferior Superior

0 <1,1 0,0 3,0

1 1,1 0,03 5,9

2 2,2 0,26 8,1

3 3,6 0,69 10,6

4 5,1 1,3 13,4

5 6,9 2,1 16,8

6 9,2 3,1 21,1

7 12,0 4,3 27,1

8 16,1 5,9 36,8

9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 Infinito

DIAGRAMA PRUEBA CONFIRMATIVA OPCIONAL PARA ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO CALDO EC-MUG (4 METIL-UMBELIFERIL--D-GLUCURONIDO)

1.4 Rastreabilidad: El volumen de la muestra de agua fue de 250 ml de agua, proveniente de un filtro de casa de la marca Pure it Unilever en Nezahualcóyotl, la muestra fue tomado con 4 días de anticipación, en condiciones de refrigeración.

2. Resultados:

2.1 Resultados número más probable (NMP)

Los resultados obtenidos de la muestra de gua de filtro de una casa de Nezahualcóyotl, se presentan en la tabla 1 y tabla 2 obtenidos en las diferentes etapas del NMP.

Tabla 1. Tubos de la Etapa presuntiva (20mL en cada tubo)

+ + + + +

+ Tubo positivo (turbidez y producción de gas)

Tabla 2. Tubos de la Etapa confirmativa, coliformes totales

+ + + + +

+ Tubo positivo (turbidez y producción de gas)

Tabla 3. Tubos EC para coliformes fecales

- - - - -

- Tubo negativo (sin turbidez y sin gas)

En la Tabla 4 se muestran los resultados de los tubos positivos para coliformes totales y fecales, obtenidos por el grupo, con diferentes muestras de agua, y diferentes cepas que fueron inoculadas.

Tabla 4. Resultados grupales

# Equipo NMP CT NMP CF Muestra Inóculo

1 4/5 4/5 Purificadora Barranca de Muerto Citrobacter

2 0/5 5/5 Agua de bebedero/ eq 1 Testigo

3 5/5 0/5 Purificadora de Iztapalapa Klebsiella

4 4/5 0/5 Bebedero de Facultad de Química Enterobacter

5 5/5 0/5 Filtro de Azcapotzalco Citrobacter

6 5/5 0/5 Purificadora Escherichia

7 4/5 0/5 Bebedero

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