Centrifugacion

Universidad Tecnológica Metropolitana

Departamento de Biotecnología

Laboratorio de Bioquímica. Práctico 3

Espectrofotometría de absorción

Introducción

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución.

Se basa en que las moléculas absorben radiación electromagnética y que la cantidad absorbida depende de forma lineal de la concentración.

Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro.

En este instrumento se puede

seleccionar la longitud de onda (λ)

de la luz que pasa por una solución

y medir la cantidad de luz absorbida

por la misma.

El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica)La espectroscopia constituye una valiosa herramienta para la determinación y caracterización de biomoléculas.

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe en longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

Espectro Electromagnético

Cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Las regiones más importantes para la espectroscopia son:

Ultravioleta: 10-380 nm

Visible: 380-780 nm

Infrarroja: 780-30.000 nm

Espectro de Absorción

En general, cada molécula tiene un determinado espectro de absorción.

En el espectro de absorción se

representa la Absorbancia vs la

longitud de onda.

Al cuantificar la concentración de una sustancia por espectrofotometría, es importante trabajar a la longitud de onda a la que esta tiene un máximo de absorción.

La fuente de radiación visible es una lámpara de tungsteno y la de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio.

Diversos factores como pH, concentración de sal y el disolvente, que alteran la carga de las moléculas, pueden provocan desplazamientos de los espectros de absorción.

Absorbancia y transmitancia

Cuando radiación de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide sobre una solución de un compuesto químico que absorbe luz (cromóforo), el compuesto absorbe una parte de la radiación incidente y deja pasar el resto

La transmitancia (T) se define como:

I es la cantidad de luz transmitida por la muestra

I0 es la cantidad total de luz incidente.

Muchas veces encontraremos la transmitancia

expresada en porcentaje:

La absorbancia (A) nos indica la cantidad de luz absorbida por la muestra y se puede definir en términos de la transmitancia como:

A = log 1/T = -log T = -log I/ Io = log Io/I

Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática y la concentración de una sustancia que absorbe en solución (cromóforo):

A = ε x l x C

en que

ε: coeficiente de extinción

l: distancia que recorre la luz por la solución (1 cm en cubetas)

C: concentración del cromóforo

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración

La absorbancia depende también de la distancia que recorre la luz por la solución (l) y de una constante denominada coeficiente de extinción (ε), que es específica de cada cromóforo.

Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de l y c. l se expresa siempre en cm (1 cm en cubetas estándar) mientras que la concentración en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1•cm-1

Este coeficiente expresado en términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM).

Cuando la concentración se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g•L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1•L•cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción específico (εs).

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de concentración altos, ε varía con la concentración.

Aunque pueden variar

en diseño, en , todos los

espectrofotómetros

incluyen ciertos

componentes

Componentes básicos de un espectrofotómetro

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de tungsteno o deuterio.

2. Un monocromador para la selección de radiación de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.

3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra. Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.

4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas.

5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida.

A la absorbancia del disolvente o solución sin muestra (todo menos lo que se quiere medir, conocido como blanco) se le asigna el valor cero.

A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta.

Objetivos

Familiarizarse con el uso de un espectrofotómetro

Realizar un espectro de absorción de dos compuestos en solución

Determinar el coeficiente de extinción molar del orto nitrofenol (ONP)

Materiales

Solución de o-nitrofenol

Soluciones amortiguadoras: buffer acetato pH 5, buffer fosfato pH 7,0, buffer tris pH 8,5

Espectrofotómetro

Procedimientos

Espectro de absorción a diferentes valores de pH

Comenzar con pH 5,0, utilizando buffer acetato

1. Tomar dos cubetas de plástico y agregar a cada una 1,5 ml buffer acetato pH 5,0. Luego a una agregar 1,5 ml de disolvente (será el blanco) y a la otra agregar 1,5 ml de solución de solución con compuesto a analizar (por ejemplo o-nitrofenol). Homogenizar con papel parafilm.

2. Comenzar a medir la absorbancia a 320 nm. Poner la cubeta con el blanco en el espectrofotómetro y ajustar absorbancia a 0. Sacar el blanco del espectrofotómetro y poner la cubeta con el cromóforo en su lugar. Leer la absorbancia y registrar

3. Aumentar la longitud de onda en 20 unidades y repetir pasos 1 y 2.

Repetir pasos 1,2 y 3 hasta llegar a 700 nm.

Registrar la absorbancia obtenida con cada longitud de onda en tabla I.

4. Repetir pasos 1 – 3 con buffer a pH 7,0 y con buffer a pH 8,5

5. Repetir todo el proceso (pasos 1 – 4) con el otro compuesto que se le proporcionará.

Comente los resultados obtenidos

Tabla I. Lecturas de Absorbancia de cromóforos a distintos valores de pH

o-nitrofenol

λ (nm) Absorbancia pH 5,0 Absorbancia pH 7,0 Absorbancia pH 8,5

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

660

680

700

Determinación del coeficiente de extinción molar del o-nitrofenol a pH 7

Para realizar esta actividad se requiere seleccionar una longitud de onda en que el o-nitrofenol absorba fuertemente (una λ de máxima absorción), a partir del espectro de absorción del o-nitrofenol.

Una vez seleccionada esta longitud de onda, se procederá a elaborar un gráfico absorbancia vs concentración de o-nitrofenol con una serie de soluciones de concentración conocida de este compuesto.

A partir de la solución stock de o-nitrofenol (1 mM) preparar 7 soluciones de 3 ml en el rango 50-500 µM, agregando buffer y agua destilada para completar el volumen de 3 ml de acuerdo a la tabla II

Tabla II

[ONP] µM Vol. sol. 1mM Buffer pH 7 Agua destilada Absorbancia

50 µM 1,5 ml

75 µM 1,5 ml

100 µM 1,5 ml

200 µM 1,5

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