CÁLCULOS DE SOLUCIONES PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN

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• CÁLCULOS DE SOLUCIONES PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN

BUFFER 1

• Se ocuparán 300 μL para cada alumno, considerando una cantidad de 45 personas se estima preparar un volumen final de 25 mL de Buffer 1.

Fundamento: es conocido como Buffer de lisis para la extracción de ADN, compuesta por sales que ayudan a la regulación de la acidez y de la osmolaridad del lisado, además está compuesta de detergentes que se encargan de romper las estructuras de membrana de la célula (Cariaga Martínez & Zapata, 2007).

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EDTA 1mM

Fundamento: (Ácido etilen diamino tetra acético). Es un agente quelante de iones metálicos (Ca++ y Mg++). Los cuales inhiben la acción de las nucleasas al no encontrar cofactores libres para su actividad, de esta manera esta solución protege el ADN. Usualmente esta solución se prepara a un pH 8, debido a la quelación eficiente que ejerce el EDTA por los iones de calcio, formando una estabilidad del complejo formado (Rodríguez Serrano, 2011).[pic 9]

Clasificación NFPA 704 (Rombo de seguridad) de EDTA

• Stock EDTA a 0.5 M para un  volumen final de 25 mL

• Preparación de EDTA 1mM a un volumen final de 25 mL

SDS 1%

Fundamento: (Dodecil sultato de sodio) detergente aniónico que actúa como agente soluble de proteínas, tejidos y membranas. Evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los desechos o residuos celulares (Velasco Mosuera, 2005).

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Clasificación NFPA 704 (Rombo de seguridad) de SDS

• Stock de SDS al 10%, tomando en relación p/v, por lo que se tomará 5 g de SDS en 25 mL de agua destilada

• Cálculos de la solución SDS al 1% a partir del stock preparado (SDS 10%)

Tritón 100X  2%

Fundamento: detergente que permite desorganizar las membranas biológicas, además de inducir la ruptura de las mismas, importante en la extracción de ácidos nucleicos (Ríos Sánchez et al, 2016).

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Clasificación NFPA 704 (Rombo de seguridad) de Tritón 100X

NaCl  100mM

Fundamento: (Cloruro de sodio). Las sales aumentan el poder iónico de la solución, ocasionando la precipitación del ADN. Es decir, el NaCl se emplea para prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que pueden afectar la pureza del ADN, además de inhibir algunas enzimas como: polimerasas, ligasas y edonucleasas de restricción (Cariaga Martínez & Zapata, 2007).

Clasificación NFPA 704 (Rombo de seguridad) de NaCl[pic 31]

Tris 10 mM  pH 8

Fundamento: (Hidroximetil amonio metano). Es un tampón biológico que mantiene el pH de la solución constante, entre un pH de 7.0-8.0.

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Clasificación NFPA 704 (Rombo de seguridad) de Tris base

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL BUFFER 1

1. En 30 mL de agua destilada presente en un vaso precipitado de 100 mL, se disuelven 0.03 g de Tris 10 mM pH 8, con la ayuda de un agitador magnético y una placa de agitación.

1. Posteriormente se agregan 0.1461 g de NaCl al 100 mM, y se verifica el pH de la solución el cual se tiene que encontrar un pH de 8. De no ser así, el pH de la solución se ajustara gotas de HCl concentrado.

1. Después se le adiciona 50 μL de EDTA y se agita a una velocidad constante.

1. Adicionar 500 μL de Tritón 100X, bajando la velocidad de agitación de la placa y adicionando el Tritón 100X suavemente.

1. Agregar poco a poco 2.5 mL de SDS al 1%, evitando la formación de burbujas.
2. Cuando la solución preparada (Buffer 1) esté completamente homogénea, pasarlo a un matraz bola de 25 mL.

1. Aforar la solución a 25 mL con la adición de agua destilada.

1. Pasar la solución final a un recipiente de vidrio color ámbar (50 mL), el cual se etiquetará y se esterilizara en la autoclave durante 15 minutos, a una temperatura de 121 °C, 15 psi. (Nota: no apretar la tapa del frasco que contiene el Buffer 1 al meterlo en la autoclave)

1. Guardar el Buffer 1 en refrigeración.

DESCRIPCIÓN GRÁFICA DEL PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL BUFFER 1

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