DETERMINACION DE LIPIDOS, GRASAS Y PROTEINAS ATRAVES DE METODOS DE LABORATORIO.

LABORATORIO

Grasa

DETERMINACION DE LIPIDOS METODO DE BLIGH Y DYER

El método se basa en la homogeneización de alimentos húmedos con metanol y cloroformo en proporciones tales que forman una fase sencilla miscible con el agua en los alimentos, que al adicionar posteriormente cloroformo y agua se separan dos fases con los materiales lípidos en la capa de cloroformo.

PROCEDIMIENTO

Pesar 10g de la muestra original y transferirlos a una homogeneizadora de alta velocidad. Agregar 30 ml de una mezcla 1:2 ce cloroformo: metanol y licua por 2 minutos a baja velocidad.

Agregar 10 ml de cloroformo y licua por medio minuto mas. Filtrar al vacío la mezcla anterior usando papel de filtro tipo Whatman N°1. Guardar el filtrado. Licuar el residuo con 20 ml adicionales e cloroformo. Filtrar nuevamente según las condiciones descritas. Lavar el residuo con 10 ml de cloroformo. La filtración puede ser sustituida por centrifugación a 3000 rpm por 15 minutos

Colocar los filtrados en un embudo separador y descartar la fase acuosa.

Colocar la fase clorofórmica en un frasco cónico de 125 ml y agregar sulfato de sodio anhidro como agente desecante. Filtrar y lavar con pequeña cantidad de cloroformo.

Recoger el filtrado en un balón de fondo redondo de 100ml previamente pesado

Evaporar a sequedad en un rotavapor a presión reducida y a una temperatura de 40 °C. Secar las paredes externas del balón. Pesar el balón con residuo de grasa

Calcular el contenido de grasa (%, m/m) en la muestra.

Colesterol

REACCION QUIMICA LIEBERMMAN-BUCHARD

La determinación cualitativa y cuantitativa de colesterol y de los esteroides en general consiste en un método rápido, basado en la reacción química de Liebermann- Buchard, en la cual el colesterol es oxidado en un medio fuertemente acido, dando origen a un producto coloreado. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración del colesterol

Determinación cualitativa de esteroides

Preparar 10 ml del reactivo de Liebermann- Buchard, generador de color: mezclar 18 volúmenes de anhídrido acético y 3.6 volúmenes de una disolución de Na2SO4 al 12% en H2SO4 concentrado, enfriar en baño de hielo durante la mezcla

En un tubo de ensayo, agregar 1 ml de una disolución de colesterol en cloroformo (1 mg/ml) y 1 ml del reactivo de Liebermann- Buchard.

Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Observar el color obtenido.

Anotar los resultados.

Proteínas

METODO DE BIURET

Es una técnica simple para la determinación de proteínas solubles. Las sustancias que contienen dos o mas enlaces peptídicos forman un complejo purpura-violeta con sales de cobre (II) alcalinas.

Es posible que el color se desarrolle por la formación de un ion coordinado, tetracuprico, con dos grupos de amida adyacente.

El desarrollo del color es diferente para cada proteína y su intensidad se puede determinar espectroscópicamente a 540 nm. La cuantificación de la proteína se lleva a cabo con una curva patrón, utilizando el principio establecido por la ley de Beer.

Un ámbito adecuado para la determinación de la masa de proteínas por este método oscila entre 20 y 40mg de proteínas.

PROCEDIMIENTO

Preparar las siguientes disoluciones

Disolución de tártaro alcalino 9.0 g de tártaro de sodio y potasio 5.0 g de yoduro de potasio, 100ml de disolución de NaOH 6 M y diluir con agua destilada hasta un volumen de 1 litro

Reactivo de Biuret: 3.0 g de sulfato de cobre pentahidratado. 9.0 g de tartrato de sodio y potasio 5.0 g de yoduro de potasio, 100 ml de NaOH 6M y diluir con agua destilada hasta un volumen de 1 litro

Disolución patrón de proteína (20.00 mg/ml): 2.000 g de proteína (gelatina desecada) disuelta con agitación constante en la disolución de tartrato alcalino. Diluir a 100.0 ml en un balón aforado, con la misma disolución de tartrato alcalino.

Utilizando 12 tubos de ensayo de 25 ml (con tapa, limpios y secos) proceder a medir (por duplicado) con las pipetas adecuadas, los volúmenes de cada disolución indicados en el cuadro. Tapar ya agitar el contenido de cada tubo de ensayo.

Calibrar el espectrofotómetro, haciendo uso del blanco (tubos de ensayo que no contienen la disolución patrón de proteína). Medir la transmitancia (%) de cada uno de la disolución preparada anteriormente, a una longitud de onda de 540 nm.

Construir una curva de calibración: absorbancia (A) en función de la concentración de proteína (mg/Ml). El coeficiente de correlación para ambas variables debe ser 0.999

Carbohidratos

PRUEBA DE MOLISCH

Todos los carbohidratos reaccionan con el reactivo de Molisch y producen una disolución color purpura. Esto ocurre porque el carbohidrato experimenta una serie de reacciones de deshidratación sucesivas catalizadas por el acido sulfúrico concentrado.

El reactivo de Molisch es una disolución al 15% de ∝-naftol en etanol. El ∝-naftol reacciona con el furfural o con el 5- hidroximetilfurfural, a través de una reacción de condensación, para producir un compuesto de color purpura

También los disacáridos y polisacáridos dan esta prueba positiva porque se hidrolizan en medio acido a los monosacáridos correspondientes.

PROCEDIMIENTO

En un tubo de ensayo, colocar 3 ml de la disolucion del carbohidrato y añadir gotas del reactivo de Molish. Agitar.

Inclinar este tubo en un angulo de aproximadamete 30° y agregar con cuidado, resbalando por las paredes, 2 ml de acido sulfurico concentrado. No agitar esta mezcla. Observar cualquier cambio entre las dos fases.

Calentar cada tubo en un baño de agua en ebullición

...