El análisis del ADN y sus aplicaciones

Cuaderno Nº 69. ADN Detective

El análisis del ADN y sus aplicaciones

En más de un caso ficticio o real se ha escuchado hablar del “análisis de ADN” para determinar parentescos e identificar criminales. Efectivamente, debido a que todos los individuos son diferentes, las moléculas de ADN permiten identificarlos y resolver casos de filiación y de criminología. Pero, el análisis de ADN tiene otras aplicaciones de interés para el hombre. Por ejemplo, sirve para diferenciar variedades de cultivos, identificar cepas de microorganismos causantes de enfermedades, reconocer animales valuados en miles de dólares (caballos de carrera, toros sementales), acelerar programas de mejoramiento genético de especies vegetales y animales, e identificar biodiversidad, entre otras aplicaciones.

El desarrollo de estas técnicas llegó de la mano de la genética humana, lo que trajo aparejado cuestionamientos éticos y sociales importantes. En esta edición de El Cuaderno se explicarán las técnicas que emplean ADN para identificar individuos y para otros fines.

Identificación de individuos: de las huellas dactilares al ADN

Cada individuo es único, y esa individualidad fue evidenciada en las huellas dactilares a fines del siglo XIX por Juan Vucetich, científico de la policía de la provincia de Buenos Aires, Argentina. Vucetich ideó un sistema para identificar a las personas por el rastro que dejaban los dibujos de las yemas de sus dedos. El primer crimen resuelto en el mundo con este sistema fue en junio de 1892 en la ciudad de Necochea, provincia de Buenos Aires. Hoy se utilizan las huellas dactilares en todos los prontuarios policiales del mundo y en el Documento Nacional de Identidad de algunos países.

El siglo XX se caracterizó, desde el punto de vista científico-biológico, por tratar de entender la diferencia entre los individuos desde el punto de vista genético. Además, desde el ámbito criminalístico se buscaron herramientas del campo de la bioquímica que permitieran identificar individuos utilizando otras muestras y evidencias biológicas, además de las huellas dactilares. Así, comenzaron a utilizarse los grupos sanguíneos y moléculas que sirven como “marcadores” (por ejemplo, antígenos leucocitarios). Pero, su potencial resultó ser limitado ya que existe poca variabilidad entre personas para esos marcadores, y porque no siempre la muestra con la que se cuenta es suficiente para realizar las pruebas.

La muestra biológica ideal para caracterizar individuos sería aquella que contenga gran variabilidad entre individuos, que se pueda estudiar incluso con muy pocas cantidades e independientemente del paso del tiempo (horas, días, meses o años), que sea automatizable y relativamente fácil de interpretar. La solución la aportaría en la década de 1980 la biología molecular y los polimorfismos del ADN.

Variabilidad o Polimorfismos del ADN

Todos los organismos tienen su ADN constituido a partir de las mismas cuatro unidades (adenina, citosina, timina y guanina). Por lo tanto, la diferencia entre los organismos radica en la secuencia de ADN, es decir, cómo estas unidades se combinan una detrás de otra a lo largo de los cromosomas. El genoma de los organismos está formado por secuencias específicas de ADN, o genes, que codifican para la síntesis de proteínas, y por el resto del ADN que no codifca para proteínas pero juega un papel importante en la estructura y función de los cromosomas. Las “secuencias no codificantes” constituyen una porción importante del genoma (por ejemplo, 98% en humanos y 15% en bacterias), y se encuentran separando un gen de otro, en los extremos de los cromosomas, en el centrómero, etc.

Como el ADN no codificante es el de mayor proporción en organismos eucariontes, existe mayor probabilidad de que las mutaciones “caigan” en esas zonas. Como las mutaciones que se producen en las regiones no codificantes no sufren una presión de selección tan importante como las mutaciones que se producen en los genes, se acumulan a lo largo de la evolución. Por eso, las regiones no codificantes aportan la mayor variabilidad a nivel del genoma.

El conocimiento de la estructura y composición del ADN de distintos organismos reveló también que los genomas eucariotas son ricos en secuencias repetidas, las cuales se encuentran dispersas en cantidad variable por todo el genoma, mayormente en las regiones no codificantes.

Además, una misma región de ADN puede tener diferentes secuencias en los individuos. Estas distintas secuencias se conocen como “variables alélicas” o alelos (uno proviene del padre y el otro de la madre). Cuando, dentro de una población, una región del ADN presenta sólo dos variantes se la denomina “dimórfica” y cuando presenta varias formas distintas se dice que es “polimórfica”. Para poder determinar si una región de ADN es polimórfica, se analiza su secuencia en varios individuos y si se encuentran muchas variantes, entonces se trata de un polimorfismo de ADN. Las regiones polimórficas aportan información importante para identificar individuos. Los polimorfismos más utilizados para la identificación de individuos son de dos tipos: i) las secuencias repetitivas y ii) las mutaciones puntuales.

Análisis de secuencias repetitivas para la identificación de individuos

Se las denomina secuencias repetitivas en tándem en número variable (VNTR por las iniciales en inglés) o ADN satélite. El ADN satélite está constituido por secuencias cortas mayormente no codificantes que se repiten en tándem, es decir, de manera continua, un cierto número de veces, en una determinada zona del ADN. Estos fragmentos se clasifican acorde a la cantidad de pares de bases (pb) que forman la unidad de repetición como satélites, minisatélites y microsatélites (>100 pb, entre 10-100 pb y entre 2-6 pb, respectivamente). Cada uno tiene utilidad en distintos estudios, por ejemplo: los satélites sirven para diferenciar especies; los minisatélites son los elementos más polimórficos en el genoma humano, por lo cual se los utiliza en la identificación de personas; y los microsatélites son muy comunes en las especies vegetales, insectos y vertebrados. Para que puedan ser utilizadas en la identificación de individuos o especies se debe conocer previamente el tamaño de las unidades de repetición y su secuencia. Por eso, las técnicas de identificación basadas en ADN satélite requieren de un cierto conocimiento previo del genoma de la especie en estudio. En general, este tipo de ADN muestra una variabilidad excepcional entre individuos, particularmente en lo que respecta al número de repeticiones en cada lugar o locus, y esto es importante para la identificación.

De la teoría a la práctica: marcas y bandas en “códigos de barra”

Es posible localizar regiones del cromosoma que tienen ADN repetitivo con una cierta secuencia por medio de:

a) técnicas que estudian los cromosomas al microscopio: permiten observar diferencias en cuanto al sitio de localización de los fragmentos repetitivos. Se debe contar con una sonda marcada fluorescentemente y tener células en estado de mitosis para observar resultados. Se aplica preferentemente para diferenciar especies.

b) técnicas de biología molecular: se utiliza mayormente la PCR para amplificar específicamente la región repetitiva (ver El Cuaderno 67). Como muestra el siguiente esquema, los individuos de una familia se pueden diferenciar por el número de repeticiones de un fragmento de ADN presente en un lugar específico de un cromosoma.

El esquema muestra un par de cromosomas paternos, y el mismo par de cromosomas maternos, en los cuales un fragmento de ADN satélite se repite. Si el padre tiene una secuencia de 20 pares de bases repetida 4 veces en el cromosoma 1, y 6 veces en el cromosoma 1’ (el cromosoma homólogo), la PCR dará como producto un fragmento de 80 pb y otro de 120 pb para ese individuo. En la madre el mismo fragmento se repite 5 veces en un cromosoma y 3 veces en su homólogo. Los hijos presentan en ese par de cromosomas homólogos una combinación de alelos de los padres para ese fragmento de ADN repetitivo. (Nota: en el Padre y la Madre las líneas representan cromosomas homólogos y NO una doble hebra de ADN.)

Importancia del análisis de ADN Satélite para la biotecnología

La localización de sectores de ADN repetitivo permite establecer “marcas” en la molécula de ADN y armar una especie de “mapa” de ese cromosoma. Por ello, las técnicas que utilizan ADN satélites se incluyen dentro de las técnicas de “marcadores moleculares”. Los marcadores moleculares basados en ADN satélites son muy utilizados en los proyectos genoma para construir un mapa de referencia en el cual ir localizando las secuencias parciales del genoma que se van obteniendo. También son de mucha utilidad cuando se quiere localizar y aislar un gen dentro de un cromosoma.

El desarrollo de un “mapa genético” por medio de marcadores es también de gran interés en los programas de mejoramiento de especies por técnicas convencionales de cruzamientos. Al contar con estos marcadores es posible analizar la composición genotípica de los individuos y diferenciar y seleccionar los descendientes deseados sin tener que esperar a que crezcan para detectar diferencias, acelerando así los tiempos de los programas de mejoramiento. Esta aplicación biotecnológica se conoce como “Mejoramiento Asistido por Marcadores” (o MAS, por sus iniciales en inglés Marker Assisted Selection). Estos marcadores también permiten garantizar la identidad y calidad de las semillas y de los animales de interés, ofreciendo así una garantía extra al productor agropecuario

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