El polo celular: El sitio de la conversación cruzada entre la absorción de ADN y la maquinaria de recombinación genética

El polo celular: El sitio de la conversación cruzada entre la absorción de ADN y la maquinaria de recombinación genética

Dawit Kidane, Silvia Ayora, [...] y Juan C. Alonso

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Abstracto

La transformación natural es un mecanismo programado que se caracteriza por la unión del ADN bicatenario libre (ds) del medio ambiente al polo celular en las bacterias en forma de varilla. En Bacillus subtilis algunas proteínas de competencia, que procesan el dsDNA y trasladan ADN de cadena sencilla (ss) al citosol, reclutan un conjunto de proteínas de recombinación principalmente a uno de los polos celulares. Un subconjunto de proteínas de unión monocatenarios, que funcionan como "guardianes", protegen a ssDNA de la degradación y limitan la carga de recombinase RecA. Entonces, los "mediadores" superan el papel inhibitorio de los guardianes, y reclutan RecA en ssDNA. Un filamento de RecA · ssDNA busca la homología en el cromosoma y, en un proceso que es controlado por "moduladores", cataliza la invasión de la cadena con la generación de un bucle de desplazamiento (D-loop). Una resolvasa de "D-loop" o "resolver" escinde esta replicación de ADN intermedia, limitada restaura la información faltante y una ADN ligasa sella los extremos de ADN. Sin embargo, si algún paso falla, los "rescatadores" repararán el extremo roto para rescatar la transformación cromosómica. Si el ssDNA no comparte homología con el ADN residente, pero contiene información para la replicación autónoma, las proteínas guardián y mediador catalizan el establecimiento del plásmido después de la inhibición de RecA. La replicación del ADN y la ligadura reconstituyen la molécula (transformación del plásmido). En esta revisión, la red interactiva que conduce a una conversación cruzada entre las proteínas de la captación y la maquinaria de recombinación genética se colocará en prospectivo.

La transformación natural es un modo de transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias que contribuye al mantenimiento y evolución de los genomas bacterianos. Desde el descubrimiento de la transformación natural de células competentes de Streptococcus pneumoniae , por Griffith en 1928 ( Griffith, 1928 ), y la identificación del ADN como principio transformador por Avery, MacLeod y McCarty en 1944 ( Avery et al., 1944 ), más de Se ha demostrado que 90 especies bacterianas son naturalmente competentes ( Lorenz y Wackernagel, 1994 , Claverys et al., 2000 , Dubnau, 1999 , Johnsborg y Håvarstein, 2009 , Sørensen et al., 2005 , Stewart y Carlson, 1986 ). La competencia es un estado fisiológico programado en el cual la bacteria puede tomar ADN del ambiente externo e incorporarlo en su genoma. Esta captación de ADN ocurre en tres etapas: unión al DNA de doble cadena (ds) en la solución externa, degradación de una hebra para hacer que el ADN sea de cadena sencilla (ss) y transportarlo a la célula ( Chen y Dubnau, 2004 , Claverys et al., 2000 , Claverys et al., 2009 , Dubnau, 1999 , Smith et al., 1995 , Stewart y Carlson, 1986 ). Si el ssDNA internalizado se recombina en el genoma, la bacteria se considera naturalmente transformada por recombinación genética (GR). La transformación implica la recombinación de genes entre linajes similares o diferentes, que representan una forma de sexo bacteriano que aumenta la variación genética permanente, y la recombinación que se produce como parte de este proceso se llama transformación cromosómica. Si el ssDNA entrante no comparte homología con el receptor, sino que tiene un potencial de autorreplicación (un episoma), puede reconstituirse en su forma de ADNc usando la función de recombinación y replicación. La recombinación que se produce como parte de este proceso se denomina transformación de plásmidos o transfección vírica ( Viret y col., 1991 , Chen y Dubnau, 2004 , Claverys et al., 2000 , Claverys y otros, 2009 , Dubnau, 1999 , Smith et al. , 1995 , Stewart y Carlson, 1986 ).

En varias especies bacterianas, como Neisseria gonorrhoeae , la competencia natural es constitutivamente expresada, mientras que en otras es estocásticamente inducida y limitada en el tiempo ( Claverys et al., 2000 , Dubnau, 1999 ). El mecanismo que controla esta inducción de la competencia natural varía entre las bacterias y no se regula en respuesta directa a la aparición de dsDNA libre en el microambiente. La competencia puede ser inducida en respuesta a condiciones ambientales específicas, como en Bacillus subtilis , que es causada por el ruido intrínseco en la expresión génica de competencia (bistabilidad) ( Solomon y Grossman, 1996 , Macfadyen, 2000 , Maamar y Dubnau, 2005 ) presencia de antibióticos o de daños en el ADN, como ocurre en S. pneumoniae , Helicobacter pylori o Legionella pneumophila , o por la presencia de biopelículas en las superficies de quitina, como en Vibrio cholera ( Claverys et al., 2000 , Claverys et al., 2006 , Dubnau , 1999 , Meibom et al., 2005 , Dorer et al., 2010 , Charpentier et al., 2011 , Lo Scrudato y Blokesch, 2012 ). Esta versatilidad sugiere que en muchas otras especies podrían existir requisitos específicos, aún no caracterizados, para la ocurrencia de competencia, de modo que muchas más bacterias pueden ser sometidas a HGT a través de esta vía.

En la etapa de competencia, se reduce la actividad metabólica de las células competentes de B. subtilis ( Nester y Stocker, 1963 ), se detiene la replicación del ADN y se inhibe la división celular ( Haijema et al., 2001 , Johnsen y otros, 2009 , Briley Et al., 2011 ), pero el sistema SOS, que se induce cuando se inhibe la replicación (véase Sassanfar y Roberts, 1990 ), es débilmente inducido (véase más adelante). La competencia natural se encuentra en un amplio espectro de Phyla bacteriano, y es clínicamente relevante porque varios patógenos humanos son naturalmente competentes y pueden adquirir resistencias a los fármacos por este mecanismo de GR, lo que lo convierte en un serio problema de salud. Las especies más estudiadas son B. subtilis y S. pneumoniae de los Firmicutes Phylum y Haemophilus influenza , Neisseria gonorrhoeae y H. pylori del Proteobacteria Phylum ( Claverys et al., 2000 , Dubnau, 1999 , Smith et al., 1995 , Stewart y Carlson, 1986 ).

La mayoría de las bacterias naturalmente competentes, como B. subtilis , S. pneumonia , H. pylori , Acinetobacter baylyi y Pseudomonas stutzeri pueden tomar ADN de cualquier fuente ( Claverys et al., 2000 , Dubnau, 1999 , Meier et al., 2002 ) Aunque estas células generalmente adquieren ADN de su microambiente, donde crecen organismos estrechamente relacionados. Otras bacterias, como H. influenza e N. gonorrhoeae sólo toman ADN de su propio clado ( Mathis y Scocca, 1982 , Sisco y Smith, 1979 , Lorenz y Wackernagel, 1994 ). Esta absorción selectiva, que depende de la presencia de una proteína de unión al ADN específica de la secuencia, permite el transporte eficiente en el periplasma de un ADN que contiene una secuencia señal de captación (USS, también conocida como secuencias de captación de ADN, DUS), que ejerce un efecto negativo Para la recombinación entre especies ( Chen y Dubnau, 2004 ). Los USS (de 9 a 11 pb de longitud en H. influenzae ) o los motivos de DUS (10 a 12 pb en especies de Neisserial) son secuencias altamente representadas (un USS o DUS cada 3,0 kb o 2,2 kb , Respectivamente) cuando se compara con la probabilidad de presentar un motivo USS en una secuencia aleatoria (una vez cada ~ 260- a 4.000 kb por genoma) o un motivo DUS (una vez cada ~ 1.000 a 16.000 kb), respectivamente ( Danner et al. , 1980 , Goodman y Scocca, 1988 , Redfield et al., 2006 , Treangen et al., 2008 ). Sin embargo, el nivel de transformación debido a la presencia de un motivo DUS y la capacidad del exceso de DUS para inhibir la transformación en especies de Neisseria son dependientes de la deformación ( Duffin y Seifert, 2010 ), lo que sugiere que esta diferencia no se debe únicamente a la absorción diferencial de ADN .

En todas las bacterias naturales competentes, la transformación del ADN también se controla a nivel de formación de un bucle de desplazamiento estable (bucle D). En B. subtilis , un segmento corto de ~ 30-nt de longitud de identidad es la longitud mínima requerida para la invasión de la hebra de ADN mediada por RecA y la formación de lazo D ( Majewski y Cohan, 1999 ), pero los factores accesorios RecA pueden controlar la estabilidad Del bucle D.

Algunas especies de Cyanobacteria, Chlorobi, Actinobacteria y Deinococcus-Thermus Phylum han demostrado ser también naturalmente transformables. Con la excepción del Deinococcus-Thermus Phylum, los pocos estudios publicados se centran en la descripción del fenómeno de la transformación más que en la descripción de los mecanismos de procesamiento del ADN, por lo que la transformación natural en estas especies no será discutida. En esta revisión resumiremos el destino del ssDNA importado y los mecanismos de integración cromosómica o establecimiento de plásmidos que conducen a un nuevo fenotipo ( Dubnau, 1999 , Lorenz y Wackernagel, 1994 ).

Diferentes barreras controlan el HGT, y entre estos sistemas de restricción-modificación (RM) previenen la transformación artificial ( células tratadas con Ca2 + o electroporadas) y la transducción viral, y reducen la conjugación del plásmido ( Arber, 2000 ). Los sistemas RM son abundantes en bacterias y tradicionalmente están asociados con un mecanismo de protección celular contra dsDNA extranjero entrante, principalmente de origen bacteriófago. La enzima de restricción no es dañina para la célula huésped, porque su dsDNA está protegido de la escisión por metilación, pero el dsDNA entrante que lleva un sitio cognado para la enzima será escindido ( Arber, 2000 ). El ssDNA lineal entrante, que está listo para iniciar recombinación mediada por RecA, supera las barreras de restricción del huésped por su naturaleza de ssDNA. Por lo tanto, el potencial efecto negativo de la restricción en la transformación entre especies no suele ser significativo en las células naturalmente competentes. Además, en algunas especies bacterianas ( por ejemplo , S. pneumoniae ), la metilación del ssDNA entrante lo protege activamente de la endonucleasa y permite la transformación sin ninguna restricción potencial ( Lacks et al., 2000 ). En H. pylori , sin embargo, las enzimas de restricción limitar la frecuencia de transformación con ADN plásmido no modificado, aunque la barrera de restricción en el ADN cromosómico es un asunto en discusión ( Ando et al., 2000 , Aras et al., 2002 , Humbert y Salama, 2008 , Pinto et al., 2005 , Humbert et al., 2011 ). H. pylori también recoge ssDNA en el citosol ( Stingl et al., 2010 ) y para explicar la limitación por restricción se planteó la hipótesis de que las endonucleasas de restricción podría actuar antes de dsDNA se convierte en ssDNA ( Humbert et al., 2011 ). Alternativamente, la sensibilidad parcial del ssDNA tomado ( Stingl et al., 2010 ) a las endonucleasas de restricción podría explicarse si no hay suficiente SsbA Hpy para inhibir el recocido espontáneo del ADNc del plásmido o el desmontaje de todas las estructuras secundarias de ADN potenciales, debido Ambos procesos conducirían a regiones transitorias de dsDNA sensibles a las endonucleasas de restricción.

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