El principio de la herramienta de ingeniería genómica CRISPR

1. El principio de la herramienta de ingeniería genómica CRISPR

En las últimas décadas, las tecnologías de edición del genoma se han compuesto de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y nucleasas efectoras transcripcionales activadoras (TALEN), que potencian los resultados científicos tanto a nivel básico como clínico ( 1 , 2 ). A pesar de los avances que se han informado en el campo de la ingeniería genómica, el uso de nucleasas ZNF o TALEN está asociado con varios obstáculos. Por ejemplo, el diseño de las técnicas de ingeniería genómica sigue siendo complejo y, por lo tanto, estas técnicas no pueden modular la expresión de genes diana múltiples. El principio en el uso de ZNF y TALEN se basa en proteínas y la toxicidad asociada es muy alta ( 3 ) (Tabla I), lo que llevó a los investigadores a descubrir una nueva herramienta de ingeniería del genoma.

Una novedosa tecnología de edición del genoma basada en endonucleasas guiada por ARN que se denominó el sistema de proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente entrecruzadas (CRISPR), alteró notablemente el panorama de la ingeniería genómica ( 4 , 5) La historia comenzó con el estudio del sistema inmune en bacterias y arqueas en un intento de dilucidar los mecanismos a través de los cuales estos organismos combaten la infección viral. En el contexto nativo, se encontró que CRISPR en combinación con la proteína Cas proporciona a las bacterias inmunidad contra las infecciones. Específicamente, se demostró que el papel de las repeticiones era reconocer los elementos genéticos móviles (MGE) y, por lo tanto, era posible cortarlos en pequeñas secuencias e integrarlos como espaciadores en el genoma de las bacterias. 

El sistema CRISPR se simplificó aún más, en función de su capacidad para interferir y participar en la inmunidad adaptativa bacteriana, que comprende la nucleasa Cas y el ARN de guía única (ARNg). En general, el mecanismo de acción principal del sistema CRISPR está mediado por la nucleasa Cas, que interactúa con el ADN y genera rupturas de doble cadena (DSB) en la secuencia de ADN, y también hace coincidir la región genómica rota con un sgRNA. El sgRNA es un ARN quimérico, que consiste en ARN CRISPR programable (ARNcr) y un ARN transactivador (ARNcr) ( 9 ). Específicamente, el sistema CRISPR-Cas incluye un grupo de proteínas, clasificadas en Clase 1 (Tipos I, III y IV) y Clase 2 (Tipos II, V, VI) ( 7 ), todas las cuales constituyen una endonucleasa de ADN guiada por ARN específica proteínas (Cas) ( 7 ,9 - 11 ). Las proteínas Cas son impulsadas

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Figura 1

Mecanismo de acción del sistema CRISPR. La acción principal del sistema CRISPR está mediada por la nucleasa Cas. Esta nucleasa se recluta en el ADN mediante la orientación del motivo PAM y genera rupturas de doble cadena en la secuencia de ADN, que coincide con la región genómica rota con un solo ARN guía. Después de esto, se llevan a cabo mecanismos de reparación de unión de extremo no homólogo o mediado por homólogos para restaurar la secuencia de nucleótidos inducida por roturas de doble cadena, causando las alteraciones genómicas anticipadas. CRISPR, agrupadas repeticiones palindrómicas cortas entre espacios regularmente; PAM, motivo adyacente protospacer; DSB, roturas de doble cadena; NHEJ, unión final no homóloga; HDR, reparación dirigida por homología.

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