Ensayos Para Reconocer Bacterias.

MICROBIOLOGÍA ll

Instituto de Tecnología

ORT

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TRABAJO PRACTICO N° 1

ANÁLISIS BACTERIOLOGICO DE AGUAS

OBJETIVO: Establecer la potabilidad del agua mediante el análisis bacteriológico de

la misma.

PRIMER DIA

Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas

Materiales necesarios por muestra a analizar

6 placas de petri estériles

1 pipeta estéril de 1 ml.

1 punta de pipeta (tip) estéril para micropipeta P 20.

1 micropipeta P 20.

120 ml de medio PCA estéril, fundido y enfriado a 45°C.

Estufa de incubación a 37°C

Procedimiento

Sembrar: 2 placas + 1 ml de la muestra

2 placas + 0.1 ml de la muestra

2 placas + 0.01 ml de la muestra

Verter: 15-20 ml de medio PCA, homogeneizar convenientemente.

Incubar: 24 horas a 37°C.

Coniformes Totales

Materiales necesarios

3 tubos con 10 ml de Caldo Mac Conkey con campanita de Durham, doble

concentración.

3 tubos con 9 ml de Caldo Mac Conkey con campanita de Durham, simple

concentración.

3 tubos con 9.9 ml de Caldo Mac Conkey con campanita de Durham, simple

concentración.

1 pipeta de 10 ml estéril.

1 pipeta de 1 ml estéril

Estufa de incubación a 37°C.

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Procedimiento

Sembrar: 3 tubos de 10 ml de doble concentración + 10 ml de la muestra de

agua

3 tubos de 9 ml de simple concentración + 1 ml de la muestra de

agua

3 tubos de 9.9 ml de simple concentración + 0.1 de muestra de

agua.

Incubar: 37°C por 24-48 horas.

Ausencia de Pseudomona aeruginosa y E. coli en 100 ml de agua

Materiales necesarios

1 frasco con 100 ml de caldo lactosado estéril, doble concentración, para E. coli.

1 frasco con 100 ml de caldo verde de malaquita estéril, doble concentración, para

Pseudomona.

Estufa de incubación a 37°C.

Procedimiento

Sembrar: frasco de 100 ml de caldo lactosado doble concentración + 100

ml de la muestra de agua.

Idem con verde de malaquita.

Incubar: 37°C por 24-48 horas.

SEGUNDO DIA

Lectura de las placas para recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas

Informar como: Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml)

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Confirmación de Pseudomona aeruginosa

Materiales necesarios

2 placas de petri con medio Agar-Cetrimida

1 ansa rulo

Estufa de incubación a 37°C

Procedimiento

Sembrar: Tomar una ansada del crecimiento en los 100 ml del caldo verde de

malaquita doble concentración y sembrar por la técnica de agotamiento

en superficie sobre una placa de Agar Cetrimida. La segunda placa se

utilizará como control de esterilidad del medio.

Incubar: 37°C por 24 horas

Confirmación de E. coli

Materiales necesarios

2 placas de petri con medio Agar-EMB o Levine

1 ansa rulo

Estufa de incubación a 37°C

Sembrar: Proceder igual que para Pseudomona aeruginosa.

Incubar: Proceder igual que para Pseudomona aeruginosa.

Detección de Pseudomona aeruginosa

Observación de las placas de Agar Cetrimidda, exposición a lámpara de UV

(longitud de onda larga). Es fluorescente.

Informar como Presencia o Ausencia.

Detección de E. coli (coli fecal)

Materiales necesarios

Tubos con agar nutritivo en pico de flauta.

1 ansa rulo.

Procedimiento:

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Observación de las colonias crecidas en las placas de Agar Levine.

A partir de colonias típicas, transferir una porción a medio con agar nutritivo en pico

de flauta.

TRABAJO PRACTICO N° 2

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LECHE FLUIDA

A. Toma de muestra:

Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros

de las granjas utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento

de las centrales lecheras o los tanques móviles de almacenamiento hay que

asegurarse de que se haya mezclado el contenido hasta hacerlo homogéneo. Se

vierte entonces una cantidad adecuada de leche en condiciones asépticas en los

recipientes de muestreo utilizando para ello un cucharón o tubo de muestreo

esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml. de

muestra), estas muestras se enfrían inmediatamente manteniéndolas a una

temperatura de 0-4 ° C, y se envían al laboratorio.

Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada),

es preferible llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfrían y envían al

laboratorio lo más rápidamente posible para que puedan comenzar los ensayos

antes de que transcurran 36 hs. Previamente al análisis, se mezclla la muestra

cuidadosamente agitando o invirtiendo el recipiente o vasija con el fin de lograr una

distribución uniforme de los microorganismos en la muestra.

B. Preparación de la muestra:

Colocar 1 ml. de leche en un tubo de dilución que contiene 9 ml. de agua

peptonada 0.1 %. Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes, tomando siempre

1 ml. y transfiriendo este volumen a 9 ml. del medio de dilución. Se hacen tantas

diluciones como sean necesarias según el número de bacterias presentes.

C. Metodología de análisis:

a. Enumeración de bacterias aerobias mesófilas.

b. Enumeración de bacterias coliformes.

c. Enumeración de microorganismos psicrotróficos.

d. Búsqueda y caracterización de Yersinia enterocolítica.

a. Recuento de bacterias totales en la leche

Para el recuento de bacterias en la leche, se siguen generalmente 2 métodos:

1- Método microscópico directo.

2- Recuento en placa.

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1- Determinación del número total de bacterias. Método de Breed- Newman

El método consiste en contar los microorganismos muertos y vivos de la muestra. La

validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras

que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número

reducido de microorganismos.

Preparación de la película

• Mezclar bien la muestra por agitación. Leche tal cual.

• Transferir 0.01 ml. al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro

marcado tiene 1 cm. de lado.

• Distribuir el material sobre el recuadro, mediante un ansa cuyo extremo forme

un pequeño ángulo recto.

• Secar el extremo al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando

que no sobrepase los 45°C.

• Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados

sumergiéndolos en xileno / etanol (50: 50) durante 25 a 30 minutos.

• Luego se seca el extendido al aire.

• Se lo tiñe con la solución colorante, sumergiéndolo durante 30 segundos. El

exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel

absorbente.

• Secar cuidadosamente al aire y una vez seco, colocarlo bajo el chorro muy

suave de la canilla hasta que ésta no tome color. Secar al aire.

Solución colorante

Solución madre al 2% de Azul de Metileno ( y fucsina) en alcohol absoluto 96°:

Se toman 30 ml. de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1000

ml. de volumen.

Examen microscópico

La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y

después con el objetivo de inmersión.

Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml. de la porción de muestra de la

siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en

racimos, éstos se cuentan como unidades individuales sólo si la distancia entre las

células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén

más próximas entre si; las células de morfología diferente o con tinción diferente se

cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a

las demás células.

Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de

partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del

preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde

(superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en

forma horizontal, y después se empieza a contar desde el centro que habíamos

tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido

perpendicular a la primera serie.

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Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de

campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a dos

milímetros de distancia de la primera serie elegida.

Se contarán entre 30 y 60 campos. Si la riqueza microbiana es menor de 30.000

gérmenes se efectuará el recuento de 50 campos. Si es de 30.000 a 300.000

gérmenes basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor de 300.000 gérmenes

se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200

gérmenes en la suma total de todos ellos.

Cálculo

Para hacer el cómputo

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