Generación, análisis, y la transformación del macrocloroplasto Patata (Solanum tuberosum) para la biotecnología de los cloroplastos

Generación, análisis, y la transformación del macrocloroplasto Patata (Solanum tuberosum) para la biotecnología de los cloroplastos

Antecedentes: para la ingeniería metabólica de los cultivos. El potencial bioconfinamiento de los transgenes, la alta expresión de proteínas y la posibilidad de organizar los genes en operones representan ventajas considerables que hacen de los cloroplastos objetivos valiosos en la biotecnología agrícola. La biotecnología de los cloroplastos ha sido reconocida durante mucho tiempo como un recurso relativamente poco explotado para permitir la ingeniería metabólica y la mejora de los cultivos1-3. Aunque la ingeniería metabólica de los plastos se ha utilizado para la bioproducción de carotenoides4, terpenoides5, vacunas6,7, fármacos8,9 y enzimas valiosas de interés industrial10,11, no se han introducido en el mercado cultivos transplastómicos comerciales. Son aún menos los estudios que se han centrado en la ingeniería de plástidos para la mejora de los cultivos, como el aumento de la eficiencia fotosintética12,13 o la mitigación del estrés biótico y abiótico14,15. Dada la bioconfinación inherente de los transgenes en los plástidos16,17, la falta de efectos de posición de los transgenes1,18, la ausencia de mecanismos de silenciamiento de genes, la producción extremadamente alta de proteínas heterólogas y la capacidad de coordinar la expresión de genes en operones

Marco teórico:  La importancia agronómica ha transformado con éxito los cloroplastos de algunos cultivos y ha generado líneas transplastomicas homoplasticas, En los últimos años la transferencia de ADN al genoma plastídico ha recibido notable atención y ya se han obtenido plantas transplastómicas, es decir plantas derivadas de células a las que se les ha transferido nueva información genética al genoma plastídico. Así, el genoma de los plástidos se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniería genética ya que esta tecnología ofrece una serie de ventajas sobre la transformación del genoma nuclear. Por ejemplo se pueden obtener altos niveles de expresión de los transgenes y elevados niveles de acumulación de las proteínas codificadas por ellos en los cloroplastos esto constituye una herramienta de aplicación muy importante cuando se quiere expresar una proteína de aplicación farmacéutica. Por otro lado, como la mayoría de las especies tienen transmisión materna de los plástidos se minimiza la dispersión de los transgenes por el polen y, en consecuencia, se tiene una ventaja ambiental a la hora de autorizar la liberación de los cultivos al medioambiente. Hasta el momento los protocolos existentes para la obtención de plantas transplantómicas se basan en la transferencia de genes por el método de bombardeo de micropartículas (ver Cuaderno Nº 28), un eficiente proceso de cultivo y selección in vitro, y la utilización de vectores con secuencias homólogas al genoma del cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en la transformación del genoma nuclear, en el plastoma la integración de los transgenes es dirigida mediante recombinación homóloga. Para lograr esto, los vectores contienen los genes de interés flanqueados por secuencias que tienen alta homología al ADN plastídico. Por otro lado, la utilización de promotores específicos del cloroplasto permite que los transgenes se expresen exclusivamente en los plástidos.

Objetivo: generar líneas de macrocloroplastos de Solanum tuberosum (patata) que sobreexpresan el gen de la proteína GTPasa similar a la tubulina FtsZ1 de Arabidopsis thaliana

Hipótesis: Logras con éxito la transformacionde cloroplastos en cultivos clave y encontrar una selección mas eficiente junto con métodos de cultivo para generar las plantas transplastomicas

Justificación:  Aunque la ingeniería metabólica de los plastos se ha utilizado para la bioproducción de carotenoides4, terpenoides5, vacunas6,7, fármacos8,9 y enzimas valiosas de interés industrial10,11, no se han introducido en el mercado cultivos transplastómicos comerciales. Son aún menos los estudios que se han centrado en la ingeniería de plástidos para la mejora de los cultivos, como el aumento de la eficiencia fotosintética12,13 o la mitigación del estrés biótico y abiótico14

Método:

- Condiciones de crecimiento de las plantas y análisis fenotípico

- Construcción de vectores de transformación.

- Generación de líneas transgénicas.

- Extracción de ADN total y análisis de PCR

- Extracción de ARN total y PCR con transcriptasa inversa

- Análisis de Southern blot

- PCR en tiempo real.

- Cuantificación de la GFP

- Microscopía confocal y determinación del tamaño de los cloroplastos.

- Microscopio electrónico de transmisión (TEM).

- Imágenes de fluorescencia mediante el proyector láser de inducción de fluorescencia (FILP).

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