Guías De Laboratorio Bioquimica

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIRIQUI

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Experimento 1.

Preparación de Soluciones Amortiguadoras

I. Objetivos:

Al finalizar esta práctica el estudiante estará en capacidad de:

1. Preparar experimentalmente diferentes soluciones amortiguadoras.

2. Determinar el pH de las soluciones anteriormente preparadas.

3. Establecer la relación entre el pH y un amortiguador.

II. Marco Teórico:

Solución amortiguadora es aquella que se opone los cambios de pH cuando se agrega ácido o álcali. Tales soluciones se utilizan en muchos experimentos bioquímicos en los cuales se necesita controlar exactamente el pH.

De la ecuación de Henderson-Hasselbalch, se puede deducir que el pH de una solución amortiguadora depende de dos factores uno es el de pKa y el otro es la proporción de sal a ácido. Esta proporción se considera igual a las cantidades de sal y ácido mezcladas en el intervalo de pH entre 4 y 10, donde la concentración de hidrogeniones e hidroxilos del medio acuoso es muy baja y se puede ignorar.

PH = pKa + log 10 [sal] / [ácido]

Tomemos por ejemplo los amortiguadores de acetato que están compuestos por una mezcla de ácido acético y acetato de sodio:

CH3COOH ↔ CH3COO- + H+

CH3COONa → CH3COO- + Na+

Puesto que el ácido acético está tan solo débilmente disociado, la concentración de ácido será casi la misma que se agregó a la mezcla; en la misma forma la concentración de iones acetato puede ser considerada como igual a la concentración de acetato de sodio añadido a la mezcla, ya que la sal estará completamente disociada. La máxima capacidad amortiguadora de la solución se cumple cuando la concentración de la sal es igual a la concentración del ácido, en este punto pH = pKa. Si el pKa del ácido acético es 4.8, en la práctica las soluciones amortiguadoras se usan en el intérvalo de pH entre 3.8 y 5.8, es decir 1 unidad alrededor del pKa. Esto se cumple generalmente para todas las soluciones amortiguadoras.

Algunas de las soluciones amortiguadoras que se usan más frecuentemente en el laboratorio se muestran en la Tabla 1. Como se dijo anteriormente, el intervalo útil para la mayoría de los amortiguadores es de una unidad de pH por encima o por debajo del valor de pKa.

El amortiguador que se escoja en un momento dado debe seleccionarse con cuidado, ya que los resultados experimentales pueden deberse a efectos específicos de los iones utilizados y no al pH. Algunos amortiguadores que producen reacciones desfavorables son: boratos, citratos, fosfatos y tris.

Tabla 1: Amortiguadores usados en investigaciones biológicas.

Ácido o base Pka pKa pKa

Ácido fosfórico 2.1 7.2 12.3

Ácido cítrico 3.1 4.8 5.4

Ácido carbónico 6.4 10.3 -

Glicil glicina 3.1 8.1 -

Ácido Acético 4.8 - -

Tris 8.3 - -

Hepes 7.6 - -

III. Materiales y Reactivos.

a) Volumétricos 100 mL, vasos químicos, balanza, potenciómetro, buretas, probetas, papel parafilm, espátulas.

b) Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 0.2 M, ácido cítrico, citrato trisódico, Fosfato dibásico de sodio, hidróxido de sodio y HCl.

Hidróxido de sodio NaOH 0.2 M

IV. Procedimiento

1. Amortiguador de Ácido cítrico/ Citrato de sodio 0.05 M

En un frasco volumétrico de 100 mL coloque x mL de Ácido cítrico 0.05 M y complete hasta la marca con Citrato de trisódico 0.05 M.

X mL 91 86 80 75 70 65 60 55 50 44 39

pH 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0

X mL 34 29 24 19 14

PH 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0

2. Amortiguador de Fosfato dibásico de sodio 0.2 M Na2HPO4

En un frasco volumétrico de 100 mL coloque x mL de Ácido clorhídrico 0.2 M a 50 mL de Fosfato dibásico de sodio y afore con agua hasta la marca.

X mL 3.5 5.8 9.1 13 18 24 30 35 40 43 45

pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.14 7.6 7.8

3.Amortiguador de Fosfato monobásico de potasio 0.2 M KH2 PO4

En un frasco volumétrico de 100 mL coloque x mL de Hidróxido de sodio 0.2 M a 50 mL de fosfato monobásico de potasio y diluya hasta 100 mL.

X mL 3.5 5.8 9.1 13 18 24 30 35 40 43 45

pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8

4. Capacidad amortiguadora de las soluciones:

 Prepare 8 tubos de ensayo. En los tubos 1 y 2 coloque 5 mL de agua destilada.

 5 ml de la solución amortiguadora preparada en (1) en los tubos 3 y 4.

 5 mL de la solución amortiguadora preparada en (2) en los tubos 5 y 6.

 5 mL de la solución amortiguadora preparada en (3) en los tubos 7 y 8.

 En todos los tubos añada tres gotas de indicador universal.

 En los tubos impares añada 0,5 de HCI 0.1 M y en los tubos pares añada 0.5 mL de NaOH 0.1 M.

 Agite los tubos y anote sus observaciones.

V. Actividades:

Resuelva:

1. ¿Cuál es el pH de una mezcla de 5mL de acetato de sodio 0.1 M y 4 mL de ácido acético 0.1 molar?

2. Cuál es el cambio que ocurre en el pH al agregar a la mezcla anterior 1.0 mL de HCI 0.1M

3. Explique el sistema de amortiguamiento del pH en el plasma de los mamíferos.

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DEPARTAMENTO DE QUIMICA

EXPERIMENTO 2

PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS

1. Objetivos:

1.1. Determinar los pKa de un aminoácido polar con carga y un aminoácido no polar, mediante titulación con álcali.

1.2. Estimar el punto isoeléctrico de los aminoácidos polares y no polares del gráfico de pH vs volumen de base.

1.3. Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante la técnica de precipitación.

2. Introducción:

El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoáci¬dos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.

Aminoácido Abrev Letra pKa1 pKa2 pKa3

Glicina Gly G 2.35 9.78

Alanita Ala A 2.35 9.87

Valina Val V 2.29 9.74

Leucina Leu L 2.33 9.74

Isoleucina Ile I 2.32 9.76

Metionina Met M 2.13 9.28

Prolina Pro P 1.95 10.64

Fenilalanina Phe F 2.20 9.31

Triptofano Trp W 2.46 9.41

Serina Ser S 2.19 9.21

Treonina Thr T 2.09 9.1

Asparragina Asn N 2.14 8.75

Glutamina Gln Q 2.17 9.13

Tirosina Tyr Y 2.20 9.21 10.46 Fenol

Cisterna Cys C 1.92 10.7 8.37 Sulfhidrilo

Lisina Lys K 2.16 9.06 10.54 ε-Amino

Arginina Arg R 1.82 8.99 12.48 Guanidinio

Histidina His H 1.80 9.33 6.04 Imidazol

Acido aspáratico Asp D 1.99 9.90 3.90 β-COOH

Acido glutámico Glu E 2.10 9.47 4.07 γ-COOH

TABLA 1: Valores de pKa de los grupos ionizables de los á-aminoácidos.

Fuente: http://www.qb.fcen.uba.ar/quimicabiologica/Tabla%20pKa.html

El pI de los -aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está cercano a pH = 6. Este valor lo podemos calcular con la siguiente ecuación:

El pI de los á-aminoácidos monoamino-dicarboxílicos se encuentra a un pH intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxílicos y en el caso de los á-aminoácidos diamino-monocarboxí¬licos entre los valores de pKa de los grupos amino.

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en éstas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.

Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristali¬zan en forma de sales insolubles a ese pH.

3. Materiales y reactivos:

3.1. Buretas, soportes, pinzas de bureta, matraces de 125 mL y 250 mL, pipetas de 25 ml, potenciómetro de pH.

3.2. Soluciones de ác. glutámico y glicina al 0.5% en HCl 0.1M; NaOH 0.2M; HCl 2%; leche de vaca, de cajita; etanol 95%; éter.

4. Procedimiento:

4.1. Titulación de aminoácidos:

Coloque una alícuota de 25 ml de la solución de aa. en un vaso químico de 250 mL y proceda a titular con NaOH 0.2 M, con adiciones de 1.0 mL cada vez, midiendo el pH antes de cada adición con un potenciómetro de pH, hasta alcanzar el pH de 10. Grafique sus resultados y reporte los valores de pKa de los aminoácidos analizados y calcule el pI en cada caso.

4.1.1. Punto isoeléctrico y solubilidad: Verifique la solubilidad de varios aminoácidos

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