Guía Bioquimica

CINÉTICA ENZIMÁTICA II

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y SU DEPENDENCIA CON LAS CONCENTRACIONES DE SUSTRATO Y ENZIMA

Recordemos que las reacciones catalizadas por enzimas pueden ser expresadas como:

De acuerdo a la ecuación (2) la velocidad inicial (Vo) de una reacción catalizada por enzimas estaría determinada por la desaparición del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentración:

Sin embargo, k2 y [ES] son difíciles de determinar directamente por lo que Michaelis y Menten derivaron la ecuación (3) en términos de otras variables que pueden ser medidas experimentalmente:

El efecto de la velocidad al variar la concentración de sustrato [S], mientras se mantiene constante la concentración de enzima [E], se observa en la siguiente gráfica:

En la Figura 1 observamos que a bajas [S], V0 incrementa casi linealmente con el incremento de la [S] (1). A concentraciones mayores de sustrato, los incrementos de velocidad inicial en respuesta a los incrementos de la concentración de sustrato son cada vez menores (2). Finalmente alcanzamos un punto donde los aumentos de velocidad son despreciables frente a los incrementos de S. En este momento decimos que la reacción enzimática tiende a velocidad máxima (3). La curva es una hipérbola rectangular que pasa por el origen y, cuyas asíntotas son [S] = -Km y Vo = Vmáx.

Las constantes en la ecuación (4) son Vmáx y Km. La Vmáx depende únicamente de la concentración de enzima y Km es independiente de la concentración de enzima y de la concentración de sustrato.

Km se define (en la deducción de la ecuación 1 y 2) como el cociente entre la suma de las constantes de disociación del complejo [ES] y las constantes de formación de dicho complejo.

Si consideramos en la ecuación de Michaelis-Menten que Vo es igual a 1/2 Vmáx (ecuación 6), se deduce que Km es numéricamente igual a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima (ecuación 7) y por eso se expresa en unidades de sustrato.

El conocimiento de Km nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato. Cuanto menor es Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. El cálculo de Km se utiliza, por ejemplo, para comparar la afinidad de una misma enzima por sustratos diferentes o de enzimas diferentes por un mismo sustrato (Figura 2).

El conocimiento de Vmáx nos da información sobre la cantidad de enzima presente ya que la Vmáx es directamente proporcional a la concentración de enzima.

A medida que aumenta la concentración de enzima aumenta el complejo [ES] y por lo tanto aumenta la velocidad de la reacción (Figura 3). Cuando se trabaja con concentraciones de sustrato saturantes, toda la enzima está formando el complejo [ES] y el aumento de la velocidad es proporcional al aumento de la concentración de enzima, es decir que estamos trabajando en condiciones de Vmáx. Si la concentración de sustrato deja de ser saturante el aumento de la actividad deja de ser proporcional, y la velocidad deja de ser máxima (Figura 3).

Teniendo en cuenta estas consideraciones, cuando se necesita conocer la cantidad de enzima presente en una muestra se recurre a la velocidad de la reacción enzimática que cataliza, en condiciones saturantes de sustrato (Vmáx). Cabe aclarar que los kits comerciales están diseñados para medir actividad enzimática dentro de un rango de concentración de enzima. Si la concentración de enzima es demasiado alta, puede suceder que la concentración de sustrato deje de ser saturante y en esos casos lo correcto es diluir la muestra problema y luego repetir la medición.

FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La actividad de una enzima se puede expresar en términos de unidades de enzima o unidades internacionales (UI). La UI (recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato en un minuto (µmol/min). La actividad específica es el número de unidades internacionales de enzima por miligramo de proteína (UI/mg de proteína).

Asimismo, es útil definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática a saturación. En una reacción michaeliana kcat= Vmáx/[Et]. La kcat, denominada también número de recambio, es una constante de velocidad de primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al número de moléculas de sustrato convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molécula de enzima, cuando la misma está saturada de sustrato.

Vmáx es proporcional a la [Et]. Entonces, Vmáx = cte. x [Et]. Dicha cte. es kcat = Vmáx / [Et]

MÉTODOS GRÁFICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE LAS ENZIMAS

Diversos métodos han sido propuestos para determinar Km y Vmáx en forma gráfica: Hanes- Woolf, Eadie-Hofstee, Lineweaver-Burk, etc. Todos ellos se basan en modificaciones de la ecuación de Michaelis-Menten para que responda a la ecuación de una recta.

MÉTODO DE LA DOBLE INVERSA (Lineweaver-Burk)

Invirtiendo y reordenando la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene la ecuación de una recta:

Al graficar 1/Vo en función de 1/[S] se obtiene la Figura 4B. De la intersección de la recta con la ordenada se obtiene 1/Vmáx y de la intersección de la recta con la abscisa se obtiene –1/Km.

La ventaja del uso del método de la doble recíproca respecto a los otros métodos gráficos radica en la determinación más precisa de Vmáx y como veremos más adelante será de utilidad en el análisis de la inhibición enzimática.

En la actualidad se usan métodos de regresión no lineal que están disponibles en diversos programas para PC, los que por aproximaciones matemáticas sucesivas (iteraciones) encuentran los valores de los parámetros cinéticos. Cabe aclarar que todas las técnicas de cálculo por métodos gráficos son menos precisas que los métodos de regresión no lineal.

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Los inhibidores de enzimas son moléculas que interfieren con la catálisis disminuyendo la velocidad de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimática, tales como: análogos de sustratos, toxinas, drogas, complejos metálicos, anticoagulantes, etc.

Los estudios sobre inhibición enzimática nos dan información sobre las vías metabólicas, una visión acerca de los mecanismos de acción de drogas y toxinas, y una mejor comprensión de los mecanismos de las reacciones enzimáticas. La determinación de Km y Vmáx tiene gran importancia y utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede determinar la presencia y tipo de inhibidor.

Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles.

INHIBIDORES REVERSIBLES

1- INHIBICIÓN COMPETITIVA

Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la unión del sustrato.

Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI]. Debido a que el inhibidor se une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del sustrato simplemente añadiendo más sustrato. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor por lo que la reacción muestra la misma Vmáx que la reacción sin inhibidor, pero Km aumenta en presencia del inhibidor (K´m) (Figura 5).

2- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La fijación del inhibidor puede o no bloquear la fijación del sustrato, pero si este último se une al sitio activo no se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye de manera efectiva la concentración de enzima activa por lo que disminuye la Vmáx aparente (V´máx). Frecuentemente el efecto sobre Km es nulo (Figura 6).

3- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA

En este caso el inhibidor se une al complejo [ES], con lo cual el valor de Km disminuye (como si la enzima tuviera más afinidad por el S). También disminuye la Vmáx ya que el complejo [SEI] es inactivo (Figura 7).

INHIBIDORES IRREVERSIBLES

Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy útiles para estudiar los mecanismos de reacción. Estos juegan un papel central en los métodos modernos para obtener nuevos agentes farmacéuticos, proceso que se denomina diseño racional de fármacos. Debido a que el inhibidor se ha diseñado para una enzima específica y no es reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo de la enzima, los fármacos basados en este método son con frecuencia muy efectivos y tienen

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