LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA

EXPERIMENTO

TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA

1. INTRODUCCIÓN:

El crecimiento microbiano se pude considerar como el incremento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares, conduce a un aumento del número de individuos en la población.

Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una población (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes (Feed Batch) y el cultivo continuo.

Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el recuento microscópico directo. Para células bacterianas y levaduras se usa frecuentemente una cámara de  Petroof-Hauser o una de Neubauer (hemocitómetro). Es necesaria una ampliación de 100X a 400X para visualizar la cámara de recuento y las células de Levaduras en suspensión, o una ampliación de 1000X para bacterias a causa de su pequeño tamaño.  El recuento microscópico directo tiene la ventaja de que permite observar directamente la morfología de las células estudiadas; de esta forma, las morfologías aberrantes o atípicas podrían indicar unas condiciones sub-óptimas de crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo alterados.

El método más usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de células que sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrífuga prepesados.  Para células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro de 0,2 μm.

Otro método muy utilizado es el de determinación de biomasa por densidad óptica. Se aprovecha la proporcionalidad de la densidad óptica con respecto a la masa celular cuando no se tienen en el medio de fermentación otros sólidos en suspensión.  Este método se basa en la Ley de Beer y Lamberty; en este caso, se asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración de células presentes.

2. OBJETIVO:

Desarrollar la habilidad y competencias para medición de la biomasa microbiana que interviene en los bioprocesos a través de las técnicas de cámara de Neubauer, peso seco, y densidad óptica.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:

Materiales

• Cámaras de Neubauer
• Microscopios
• Estufa
• Vortex
• Desecador
• Balanza analítica (6 cifras decimales)
• Espectrofotómetro
• Centrífuga
• Pipetas graduadas
• Pipetas automáticas
• Auxiliar de pipeteo
• Beakers
• Erlenmeyers
• Tubos para centrífuga
• Pinzas

b) Reactivos

• Cultivo de Levadura
• Agua destilada
• Solución salina isotónica estéril (0,85%)

4. PROCEDIMIENTO:

1. Preparación de las soluciones problema, a partir de cultivo madre de levadura:

A partir de una solución madre de levadura seca comercial, previamente preparada (Saccharomyces cerevisiae) se prepararon soluciones problema en tubos de ensayo de 20 mL, previamente secos en estufa durante una noche a 95 ºC, para obtener 6 diluciones de levadura a partir del cultivo madre, así:

Foto: Fig. 1 

Cada dilución se midió con las siguientes técnicas:

1. Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de Neubauer:

Luego de preparadas las soluciones problema del cultivo de levadura, se agitaron en un vortex. Y se procedió a tomar aproximadamente 0,5 mL de la solución con un gotero desechable estéril. Se depositó una alícuota de la solución en la cámara de Neubauer (entre la superficie pulida de la cámara y el extremo del cubreobjetos); la suspensión entró en la cámara por capilaridad.

Posteriormente se ubicó la cámara en la platina del microscopio compuesto y se enfocó la cuadrícula con los objetivos de menos aumento (4X y después 40X) para visualizar la cámara.  Para contar las levaduras se utilizó el cuadro central (Ver figura 2), señalado con un circulo. Se ajusto la intensidad de la luz procurando una buena observación de las líneas y células de levadura.

Se contaron  las células presentes dentro de los 5 cuadros marcados con sombra en la figura 2 (los cuatro de las esquinas y el del centro).

Según las características de la cámara de neubawer se establece que el cuadro central (marcado con el círculo) tiene un área de 1 mm2 y una profundidad de 0.1 mm.

Se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos:

• Para aquellas células que estén tocando las líneas de los bordes, sólo se cuentan aquellas que estén en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto evitará que se repita el conteo.
• Si  se cuentan más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de muestra o cambie la dilución que esté usando.
• después de cada lectura se limpia la cámara con agua destilada estéril y se seca  con papel delicado.

[pic 1]

[pic 2][pic 3]

Figura 1.  Cámara de Neubauer      

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