Laboratorio de determinacion de crecimiento bacteriano

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METODOS PARA EVALUAR EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Programa de Biología, Facultad de ciencias, Universidad del Tolima

SHARON PENAGOS JARAMILLO 070100442014

KATHERIN LEAL GONZALEZ 070150222014  

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RESUMEN

El crecimiento microbiano es el incremento ordenado de todos los constituyentes celulares que conduce a un aumento de masa y finalmente a un aumento en el número de células.

El recuento es un procedimiento que permite conocer el número de microorganismos que hay en una muestra. Para este propósito, existen diferentes métodos mediante los cuales se pueden contar microorganismos vivos (recuento de viables), o bien vivos y muertos (recuento de totales). A su vez todos los tipos de recuento, se pueden clasificar en directos e indirectos. Un recuento directo es aquel en el que se cuentan las células por observación directa al microscopio, y el recuento indirecto es aquel en el que se determina el número por crecimiento o alguna propiedad de los microorganismos

Palabras clave: crecimiento, recuento, células viables, células totales, directo, indirecto.

ABSTRACT

Microbial growth is the ordered increase of all cellular constituents leading to a mass increase and ultimately to an increase in cell number.

The count is a procedure that allows to know the number of microorganisms in a sample. For this purpose, there are different methods by which you can count live microorganisms (viable count) or living and dead (total count). In turn all types of count can be classified into direct and indirect. A direct count is one in which the cells are counted by direct microscopic observation and indirect count is one in which the number of microorganisms is determined by property or growth

Keywords:  growth, count, viable cells, total cells, direct, indirect.

INTRODUCCION

En la mayoría de estudios microbiológicos es requerido el conocimiento del número de microorganismos que están presentes en el material que es motivo de estudio, ya sea para determinar su estado y la calidad; en el caso de los alimentos para saber si es apto para el consumo humano  o para determinar el grado de contaminación a la que está expuesto el material.

Para establecer la cantidad de microorganismos en una muestra pueden  utilizarse diferentes métodos; que están divididos en dos grandes grupos los directos y los indirectos. En los directos encontramos:

Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.

Peso seco: La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Una desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica absorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles.

Cámara de Neubauer: estas cámaras son portas excavados modificados que tienen marcada una rejilla en su superficie con cuadros de  área conocida, y es utilizado para contar el número de células por unidad de volumen de suspensiones bacterianas.

Métodos indirectos:

Espectrofotometría: Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. Es un método de análisis óptico en el que se utiliza el espectrofotómetro, que es el que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Número más probable: es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.

El método se basa en determinar la presencia o ausencia de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. El método requiere la realización de una sucesión de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento del organismo de un volumen diez veces mayor. Luego las muestras son incubadas  y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.

Recuento de células viables: para los casos en los que se quiere contar las células capaces de dividirse (vivas) este tipo de conteo se efectúa determinando la cantidad de células en una población que son capaces de dividirse y formar colonias. Para llevarlo a cabo es usual utilizar el método de conteo en placa del cual hay dos versiones: el de placa vertida y el de placa extendida.

-Método de placa extendida: En el método de la placa extendida, una muestra generalmente pequeña de 0,1 ml se extiende asépticamente sobre la superficie de una placa de cultivo con el medio adecuado y bien seco y se incuba hasta que las colonias son visibles a simple vista. Se entiende que cada colonia se originan de una sola célula por lo tanto contando el número de colonias se puede calcular la cantidad de células viables de la muestra.

-Método de profundidad: Con el procedimiento de la placa vertida, la muestra se mezcla con el agar el cual debe encontrarse a una temperatura de 45 a 50ºC colocándose posteriormente sobre la placa de Petri estéril. Los microorganismos quedan entonces fijos dentro del agar y forman colonias. Con las placas servidas se pueden emplear volúmenes de muestra de 1,0 ml o más, siendo posible el recuento de lodos o suspensiones como las que se obtienen de alimentos o medios homogeneizados.

MATERIALES Y METODOLOGIA

Tubos de ensayo con 9 mL de agua peptonada.
Erlenmeyer con 90 mL de agua peptonada.
Cajas de Petri con agar PDA y agar nutritivo.
Cajas de Petri estériles.
Agar nutritivo de 45 a 50 °C.
Agar PDA de 45 a 50°C.
Balanza.
Pipetas estériles de 1 mL.
Asas Digralsky.
Mecheros de Bunsen.
Muestra de tierra de jardín.
Incubadora.
Caldo bilis verde brillante.

Cuenta en placa de bacterias

Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia y homogenizar con 90 mL del diluyente, realizar diluciones seriadas 1/10⁻¹, 1/10⁻², 1/10⁻³, 1/10⁻⁴, 1/10⁻⁵; a partir de la suspensión inicial.
Se utilizan las muestras de los tubos con la dilución -3, -4, y -5.

Para el método de placa extendida 
-con una pipeta se toma 0,1 mL de cada una de las diluciones
-se vierten sobre el agar en cada caja de Petri, 2 repeticiones por dilución.
-esparcir con el asa sobre toda la superficie de la caja con movimientos circulares
-incubar las cajas a 37 °C durante 24–48 horas.

En el método de profundidad 
- pipetear  1 mL de cada dilución y llevar a las cajas de Petri estériles; dos repeticiones por dilución.  
-verter de 15 a 20 mL de agar nutritivo o PDA temperado a 45 °C.
-mezclar con cinco movimientos circulares suaves en dirección a las agujas del reloj y cinco en la dirección contraria.
-dejar enfriar hasta que solidifique
- incubar a 37 °C de 24- 48 horas.

Numero más probable

Vertido en placa

Utilizando las mismas diluciones en serie se procede a inocular las Placas Petri: Utilizando un marcador, dividiendo la placa petri en cinco zonas de igual tamaño. Rotular cada zona con el factor de dilución a ser inoculado.

Luego se transfiere 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repitiendo  esta operación cinco veces por cada dilución. Dejar secar el inoculo e incubar.

Caldo brila

1. A partir de cada una de las diluciones anteriores se procede a inocular los tubos que contienen el caldo Bilis Verde Brillante; tres repeticiones por tubo.

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