Laboratorio Microbiología I Aislamiento Bacteriano

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Laboratorio Microbiología I

Aislamiento Bacteriano

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Introducción

La microbiología, es el estudio de la biología de los microorganismos que son organismos microscópicos como bacterias, hongos, protozoos, Archeas, virus (son microscópicos pero no celulares).

Para poder estudiarlos  se deben “aislar”, es decir, separar un microorganismo desde una población natural donde hay millones o billones de estos; y luego se debe realizar un cultivo  con los requerimientos nutricionales necesarios (medio del cultivo)  donde se produce el crecimiento de poblaciones.

En el laboratorio se realizaron cultivos bacterianos con la técnica de siembra en estrías en agar en forma continua, cuadrante y en 45°. Además con una micropipeta se sacaron 10 ul de una micro alga llamada Chlamylomanas sp  y se inoculó en la placa petri realizando siembra continua.

También se realizó la técnica de siembra por dilución utilizando la misma micro alga.

Los objetivos del laboratorio realizado, materiales y métodos utilizados y sus resultados  se muestran en el presente informe.

Objetivos

• Aprender técnicas de cultivo bacteriano , siembra por estrías en forma continua , cuadrante , 45°y siembra por dilución .

• practicar para mejorar las técnicas de sembrado.

• familiarizarse con los instrumentos y materiales necesarios para realizar las técnicas de siembra.

Materiales y métodos

Materiales

El propósito de la práctica realizada en laboratorio, fue utilizar técnicas de cultivo bacteriano donde se utilizaron placas petri  y tubos para realizar las diluciones, además de micropipetas para extraer los 100 ul requeridos.

Para sembrar las bacterias se utilizó un asa de metal, las placas petri contenían un medio llamado TSA, el cual permite el crecimiento de los microorganismos y permite ver reacciones que producen las especie bacteriana utilizada del genero Vibrio.

Al sembrar las bacterias fue necesario estar máximo alejado 10 cm de un mechero ya que dentro de ese sector el ambiente se encuentra estéril y se previene contaminación.

Por último una vez realizada la siembra en las placas petri, se cerraron con un plástico parafin por el borde, para evitar el ingreso de agentes contaminantes.

Métodos:

Para comenzar la práctica de laboratorio, se procedió a limpiar toda la zona de trabajo con etanol.

El grupo de laboratorio se dividió en dos, a una parte le tocó realizar diluciones con una microalga llamada Cylindrotheca closterium mientras que al otro (donde pertenecía), la microalga Chlamydomonas  sp .

Para realizar las diluciones se utilizó un tubo de

Para comenzar con la extracción, se procedió agregar una colonia de la solución del kit Microbead 300 ul  en un tubo Microbead y se mezcló gentilmente la solución con el aparato vortex, luego se agregaron 50 ul de la solución MD1 al tubo Microbead por 10 minutos a máxima velocidad  seguidamente se centrifugó a 10.000 g. Hasta el momento ya se han eliminado lípidos y elementos pesados debido a que la solución MD1 contiene SDS (detergente aniónico que descompone ácidos grasos y lípidos) y otros agentes necesarios para la lisis de las células. El siguiente paso fue transferir el sobrenadante observado a un tubo limpio de 2 ml y agregarle 100 ul de la solución MD2, se agitó en vortex por 5 segundos y después se incubó a 4°C por 5 minutos, seguidamente se retiró de la incubadora se centrifugó a temperatura ambiente por 1 minuto a 10,000 xg (en este paso se precipitan proteínas y restos de células), evitando tomar el pelet se transfiere el volumen completo del sobrenadante a un tubo limpio de 2 ml. A continuación se agitó la solución MD3 (esta solución es alcalina, y sirve para que el ADN se una a la columna en el paso siguiente), luego se le agregó 900 ul de la solución al sobrenadante y se agitó en vortex por 5 segundos.

En este paso se utilizo una columna (membrana de filtro giratorio) que viene incluida en el kit a la cual se le une el ADN.

Se agregaron 700 ul en la columna se centrifugó a 10,000 xg por 30 segundos a temperatura ambiente , se descarto el flujo y agregó el remanente del sobrenadante a la columna y se centrifugó a 10,000 xg por 30 segundos a temperatura ambiente ( se utilizaron 3 cargas de cada muestra) , y se descartó el filtrado .

El propósito de la práctica realizada en laboratorio, fue utilizar una técnica para realizar una extracción de ADN, el cual fue extraído de una bacteria encontrada en una planta  llamada Salicornia.

Se utilizó el kit Ultraclean Mobio el cual contiene las soluciones MD1, MD2, MD3, que sirven para separar los lípidos, proteínas, el ADN, MD4 para limpiar mas el ADN, eliminando los residuos de sal, la solución contiene etanol, y MD5 que es un tampón para que el ADN se libere al final del procedimiento.  

Durante la realización de los procedimientos se necesitaron implementos como el vortex  que agita la muestra para que las células se rompan, centrífuga, que separa por peso molecular, las moléculas más pesadas se van al fondo y queda un sobrenadante, además se utilizaron  micro-tubos, Incubadora y micro pipetas.

 y posteriormente sembrauna extracción de ADN, el cual fue extraído de una bacteria encontrada en una planta  llamada Salicornia.

Se utilizó el kit Ultraclean Mobio el cual contiene las soluciones MD1, MD2, MD3, que sirven para separar los lípidos, proteínas, el ADN, MD4 para limpiar mas el ADN, eliminando los residuos de sal, la solución contiene etanol, y MD5 que es un tampón para que el ADN se libere al final del procedimiento.  

Durante la realización de los procedimientos se necesitaron implementos como el vortex  que agita la muestra para que las células se rompan, centrífuga, que separa por peso molecular, las moléculas más pesadas se van al fondo y queda un sobrenadante, además se utilizaron  micro-tubos, Incubadora y micro pipetas.

Objetivos de laboratorio, materiales y métodos, resultados, conclusiones y bibliografía.

Los materiales utilizados,

A continuación se referirá a las tres técnicas comúnmente utilizadas en laboratorio para sembrar muestras de cultivo bacteriano.

Siembra en estrías o rayado sobre el agar.

Cultivos bacterianos pueden realizarse sobre la superficie del agar en una placa de Petri, a través del sembrado en estrías con un asa metálica estéril. Para esta técnica es necesario preparar placas con medio de cultivo sólido (1,5- 2,0% agar bacteriológico). El objetivo de las estrías es producir colonias de bacterias en forma separada sobre el agar, a través de la distribución de un inóculo bacteriano proveniente de una suspensión de células concentradas. Al comenzar el estriado sobre el agar, las células quedan dispuestas en forma agrupada, pero al continuar el estriado las células se van liberando paulatinamente desde el asa quedando distribuidas en forma cada vez más separada sobre el agar. Una buena placa resulta de varios movimientos continuos del asa sobre el agar. El inóculo puede ser una pequeñísima cantidad de células provenientes de una colonia previamente cultivada, o bien provenir de pequeñas gotas de cultivo o suspensiones bacterianas (por ejemplo, gotas de agua de mar, homogenizado de tejido animal, secreciones, mucosidades, etc.). Finalmente, las placas se sellan y dejan incubando en forma invertida.

Aislamiento por estrías en agar.

Células bacterianas pueden aislarse fácilmente por estrías en agar. Esta técnica se basa en la siembra en forma de estrias y consiste en disponer una gota de la muestra líquida o una pequeñísima cantidad de una colonia sobre el agar a través de un asa metálica estéril. Con el asa se realiza continuos rayados sobre la superficie del agar. Posteriormente, las placas se incuban por 48 horas o más, hasta poder visualizar las microcolonias bacterianas que se forman sobre el medio de cultivo. Finalmente, las colonias o unidades formadoras de colonias (UFC) son trasladadas a un medio de cultivo (líquido o sólido) nuevo.

Aislamiento por dilución.

Esta técnica se utiliza cuando la bacteria que se desea aislar está en abundancia. El principio básico es estimar la densidad poblacional de una muestra y efectuar diluciones necesarias para reducir la densidad, teóricamente, a una o unas pocas células. Por ejemplo, se toma 1 ml de una muestras (dilución 100), a la cual se le estimó bajo microscopía una concentración de 106 células/ml, y se inocula en un tubo de 9 ml de SSM estéril (dilución 10-1). Luego se homogeniza el tubo con la dilución 10-1 y se le extrae 1 ml para inocular otro tubo con 9 ml de SSM estéril (dilución 10-2). Esta operación se realiza sucesivamente hasta obtener la dilución 10-6, la cual teóricamente contiene una concentración de 1 célula/ml. Posteriormente, se realiza la siembra en forma extendida de las últimas diluciones (10-4, 10-5 y 10-6) sobre medio de cultivo enriquecido. Estas placas se incuban hasta poder visualizar las UFC para luego ser traspasadas individualmente a nuevos recipientes de cultivos.

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