METODOS GENETICOS

Páginas 233-241

METODOS GENETICOS

Se trata de realizar la hibridación descrita en el capítulo 8 sobre los cortes de tejido, debidamente fijados (tabla 6.4).

Los primeros experimentos de este tipo demostraron que los tejidos y células desnaturalizados contribuían significativamente al fondo. Además el ácido nucleico viral esta físicamente atrapado entre los restos celulares, lo que reduce su accesibilidad a las sondas. Por ello las condiciones de hibridación para cada caso particular deben primero estudiarse utilizando membradas de nitrocelulosa y sondas marcadas radiactivamente. Una vez optimizadas las condiciones, se pueden aplicar al problema completo estructural.

El tejido o las células pueden congelarse a -70 grados centígrados y guardarse indefinidamente. Los cortes deben ser 5-10 u y descongelarse en portaobjetos cubiertos con 1 por 100 de gelatina fijada con 0,25 por 100 de formaldehido. Después se fijan en 4 por 100 glutaraldehido en 0,1 M fosfato, pH 7,3 a 0 grados centígrados durante 5 minutos. Los cortes se pre hibridan al menos por 1 hora a 40 grados centígrados, usando la formulación de Denhardt´s con 50 por 100 forma mida. Para lavar se puede utilizar etanol y los cortes se pueden guardar a -20 grados centígrados secos. Este procedimiento se puede usar para especímenes de 5 mm3, y es compatible con el revelado utilizando per oxidasa. Los tejidos se pueden también incluirse en parafina convencional, excepto que se evita una exposición prolongada al calor de la parafina fundida, y las inclusiones se deben guardar a -20 grados centígrados. Los procedimientos de obtención de sondas, de hibridación y de detección, son similares a los métodos descritos en el capítulo 8.

Tabla 6.4 Procedimiento para la hibridación in situ

Paso Método

Preparación tejido

Hibridación

Lavado

Revelado

Tenido Congelar en hexano a – 20 °C.

Cortar a – 15 °C.

Fijar a – 4 °C.

Pre hibridación a – 40 °C 2 horas con Denharts en forma mida.

Hibridación a – 40 °C ≥6 horas con sonda marcada.

Incubar a – 40 °C 1 hora en IXSSC (0.15 M ClNa, 0.015 M citrato sódico).

Dependiendo del marcaje de la sonda.

Tinción de contraste con hematoxilina/eosina

5. Microscopia electrónica

Cuando un haz de electrones incide en el vacío sobre un objeto, los electrones incidentes pueden ser absorbidos, pueden ser transmitidos o bien modificarse de distinta manera. Los electrones transmitidos, tras la absorción parcial por parte del objeto, sirven para formar la imagen en el microscopio electrónico de transmisión. Una metalización de la superficie del objeto permite mejorar la emisión de electrones, de la que as u vez depende el contraste de la imagen. Los materiales biológicos extremadamente frágiles presentan el riesgo de sufrir alteraciones en el transcurso de la metalización, pero es una condición imprescindible que el material observado al microscopio electrónico sea conductor, es decir, que esté metalizado.

Para observar las muestras virológicas pueden depositarse sobre rejillas especiales directamente (por ejemplo, sobrenadantes de cultivos infectados) o después de cortadas con micrótomos. Cuando se evapora el líquido de la muestra, la tensión superficial tiende a dejar los virus o los cortes extendidos sobre el soporte plástico (formvar) de la rejilla.

Una vez depositadas las muestras sobre las rejillas, se procede a su tinción por metalización (tinción negativa). Para la metalización de las muestras, se deposita una capa de oro, de platino, de cobre, de germanio o de una aleación oro-paladio o de oro-cobre que no llegue a sobrepasar los 100 A (1A= 0,0001 u). Esta metalización se efectúa directamente sobre la muestra o tras un recubrimiento previo de carbón, en el caso de que se quiera preservar al máximo la forma, evitando las retracciones. El poder de resolución teórico tras la metalización es de 80 a 200 A.

Figura 6.12.

Para la preparación de las rejillas se limpian portaobjetos de vidrio con ácido clorhídrico alcohólico durante 24 horas, se enjuagan con etanol, se secan y se conservan resguardados en polvo. Los portaobjetos se recubren de plástico (formvar) y se utilizan para recubrir las rejillas con esta membrana.

Se disuelven 0,2 g de formvar en 100 ml de dicloroetano, se filtra y conserva frío, calentando previamente a temperatura ambiente antes de utilizarlo. Los portaobjetos se sumergen en la solución de formvar, dejando evaporar algunos minutos. Después se depositan cuidadosamente las rejillas sobre la membrana de plástico.

Figura 6.13.

Bajo una campana en la que hay un vacío elevado, se evapora por incandescencia un filamento del metal escogido. Para el recubrimiento con carbono se hace saltar un arco entre dos electrodos de grafito. El ángulo de incidencia provoca una acumulación del metal o carbón en una de las caras de la muestra y una falta en la sombra. Estos dos fenómenos dan la apariencia de relieve que se observa después en las imágenes de microscopia electrónica por este método.

El portaobjetos se coloca en una caja de Petri con las rejillas una por una y se controlan las membranas con el microscopio de contraste de fases para desechar las que no están correctas: arrugadas, agujereadas o ausentes. Las rejillas preparadas de esta manera se conservan resguardadas del polvo y de la luz.

Los virus pueden cuantificarse en términos de número de partículas, independientemente de su capacidad infecciosa o no. Aunque un virus es capaz de causar infección, no todos los virus presentes en una suspensión son capaces de hacerlo, generalmente, el número total de virus excede al número total de partículas víricas, el método más exacto consiste en mezclar infecciosas respecto al número total de virus está en el rango

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