METODOS PARA DETERMINACION DE ANTIBIOTICOS

METODOS PARA DETERMINACION DE ANTIBIOTICOS

El uso incorrecto de estos productos puede dejar residuos en el tejido comestible. Los residuos de antibióticos pueden tener efectos tóxicos directos en el consumidor como: reacciones alérgicas en individuos hipersensibles o pueden causar problemas indirectos a través de la inducción de resistencia a bacterias. Generalmente, la determinación de antibióticos se lleva a cabo por pruebas cuantitativas para especificar las cantidades de residuos de sustancias antibacterianas. (Masakazu, et al, 1998). Por lo que el monitoreo de estos residuos es necesario para asegurar que no están presentes a niveles que puedan poner en riesgo la salud de los consumidores. Las metodologías analíticas han sido exitosamente desarrolladas para identificar y cuantificar estos compuestos. En la literatura científica se establece la descripción de diversos métodos disponibles para realizar estas determinaciones. (Rick, W. F. 1998). En la ganadería se utilizan muchas clases de antibióticos que están disponibles en el mercado, en México existe también la norma oficial NOM-059-ZOO-1997 que establece las especificaciones de los productos químicos, farmacéuticos, biológicos y alimenticios para uso en animales o consumo de estos. Los principales grupos utilizados son los β-Lactamicos, tetraciclinas, aminoglucosidos, cloramfenicoles, péptidos, ionoforos y macrolidos. (Norma Oficial NOM-059-ZOO. 1997).

TETRACICLINAS.

Las tetraciclinas derivadas de los estreptomyces ssp son activas a una amplía gama de organismos Gram positivos y negativos. Ellas actúan inhibiendo la biosíntesis de la proteína a través de la fijación a la unidad ribososmal 30. La falta de volatilidad de tetraciclinas es requerida para la GC-MS. (cromatografía de gas de espectrometría en masa). Sin embargo, LC-MS,  se ha aplicado exitosamente a los análisis de estos componentes por muchos años.

Kijak, (1991) desarrolló un método analítico para la determinación de las tetraciclinas, oxitetraciclinas y clorotetraciclina en la carne, utilizando columnas  de LC-MS. Se filtro una muestra de carne, y fue puesta en un cartucho de C19 SPE que había sido previamente acondicionado, lavándolo con metanol y agua. Las tetraciclinas residuales fueron removidas con ácido oxálico. Ellos utilizaron una columna Hewlett- Packard HP5988A. Una columna Nova- Pak C18 fue utilizada con una fase móvil isocratica que consistió en 0.05mol de acetonitrilo y ácido oxálico- metanol (50: 30: 20, v/v.v). Esto dio una sensibilidad óptima a expensas de la separación cromatográfica incompleta de las tetraciclinas.

Ellos usaron el metano como un reactivo para la ionización química de los iones negativos. El monitoreo para los iones seleccionados (SIM) fué utilizado para controlar cuatro iones para cada compuesto.

Los datos de validación para el método fueron presentados en las concentraciones equivalentes a 100µg/l. El ácido oxálico se ha utilizado en la fase móvil empleada para varias pruebas de HPLC para las tetraciclinas. Esto mejora la recuperación previniendo la quelacion de las tetraciclinas por los iones metálicos disminuyendo la degradación de estos compuestos. Sin embargo, llegan a ser no volátiles si no son totalmente compatibles con LC- MC. Kijak (1991) reporto que los roces particulares de la columna necesitan limpiarse después de 10 a 15 análisis. La introducción de una válvula interruptora ayudo a resolver este problema.

En 1997, se reportó el desarrollo de un método para deteccion de la tetraciclina, la  oxitetraciclina y  clorotetraciclina en músculo y en riñón utilizando la ionización química de presión atmosférica en LC-MS. Las muestras fueron extraídas en glicina del HCl. Después de la adición de Sulfato de amonio, el extracto fué centrifugado y una alícuota del supernadante se limpio utilizando un cartucho de solución de ciclohexil (última capa de CH) que se reacondiciono lavándola con metanol y agua. Las tetraciclinas fueron limpiadas con metanol, los residuos secos fueron reconstituidos en la fase móvil, que consisten en 20 mM. De ácido oxálico, 10 mM de acetonitrilo EDTA (80: 20, v/v). Se utilizo una columna de Inertsil ODS- 2. Las muestras fueron analizadas utilizando un espectrómetro de masa cuádruple VG Platform II. El ajuste del voltaje a través del roce del conos induce una suficiente fragmentación para permitir el monitoreo de por lo menos 3 iones. Para cada uno de los compuestos, los iones monitoreados corresponden a (M+H), (M+H – NH3) Y (M+H-H2O). La fase móvil permitió la resolución de vaselina de las tetraciclinas. El método fué validado de los 50 a los 200µm/kg en músculo y de 300 a los 1200µm/g en riñón (una mitad para duplicar el MRL). El rango de recuperación va desde el 59 al 72 %. Encontraron que la adición de ácido oxálico fué necesaria para mejorar la resolución y punto clave. Por otro lado, el EDTA fué adicionado para mejorar la recuperación ganada. Otros trabajos han encontrado que el ácido oxálico solo fue suficiente, pero la adición de EDTA previno la completa, la retención de tetraciclinas en la columna. Cuando las muestras contenían clortetraciclina se analizaron usando este método; la clortetraciclina, la 4 epiclorotetraciclinas y 2 componentes adicionales, identificados tentativamente como quetoclortetraciclinas y 4 epiketoepiclorotetraciclinas . El uso de LC-MS en el análisis de los residuos de la tetraciclina ha producido tres métodos validados que son capaces de producir múltiples iones que facilitan la confirmación de estos compuestos en concentraciones relevantes. La LC- MS aparece también para ofrecer una oportunidad para cuantificar y estudiar los isómeros estructurales de la clortetraciclina que pudieran ser importantes para evaluación del contenido de los residuos totales en la alimentación humana. Los límites de detección van de 10µg/kg en músculo y 20µg/kg en riñón. La medida de proporción iónica, por ejemplo: en m/z 410, 427, 445 para tetraciclina se evaluaron para la confirmación.

AMINOGLICÓSIDOS.

Los estreptomyces spp y las micromonosporas spp. Producen aminoglucósidos. Los antibióticos de amplio espectro consisten de un anillo de aminociclitol (2 deoxiestreptaminas en varios casos) conectados a 2 o más amino azúcares en un enlace glucosidico. El análisis analítico de los amino glucósidos ha sido siempre un área sumamente débil para los analistas. Estos compuestos exhiben todas las propiedades fisicoquímicas que dañan el desarrollo de métodos confirmatorios adecuados. Ellos son básicos y muy hidrofilicos, haciendo difíciles las extracciones de matrices biológicas complejas; ellos son térmicos haciendo que los análisis de GC o GC-MS sean virtualmente imposibles. Aunque la LC-MS podría ser una herramienta ideal para analizar estos compuestos, solo dos métodos han sido reportados, ambos utilizan aerosol de iones de LC-MS (McLaughlin, 1992)

McLaughlin y Henion (1992) desarrollaron un método analítico capaz de detectar la espectomicina, higromicina B, estreptomicina y dihidroestreptomicina en  riñón bovino. La poca solubilidad de estos compuestos en solventes orgánicos se separó por el uso de matriz de dispersión en fase sólida. El riñón homogeneizado se mezclo con Bondesil cianopropil 40. A continuación, posteriormentes se empaco en 8 ml de la reserva de extraccion, y la fase sólida fué lavada con hexano, etilacetato, metanol y 50% de metanol acuoso bajo una presión reducida (2 en Hg; 1 en Hg= 3386. 38 Pa). Los analitos se aclararon con agua, seguida de 0.05m de ácido sulfúrico bajo presión reducida (1 en Hg). Una alícuota de la solución se concentró a un factor de cuatro y se neutralizo utilizando amonio antes del análisis utilizando ionoaerosol de LC-MS. Una columna de Esperisorbo ODS- 2 fue utilizada con una fase móvil que consistió de 8% de acetonitrilo conteniendo ya sea 10 o 20 mM de ácido pentafluoropropionico como un reactivo que aparea iones. Utilizando una proporción dividida de 5:1, el efluente de columna se introdujo en un intrumento Sciex Taga 6000E triple-cuádruple con una fuente APCI. Utilizando SIM en m/z 351 para espectinomicina (M+H2O+H), m/z 265 para higromicina B ((M+2H)2), m/z 301 para estreptomicina (M+H2O+2H(2) y m/z 293 para dihidroestreptomicina (M+2H)2; estos antibióticos pueden ser detectados en el riñón bovino a una concentración de 20 000 mg/kg. McLauglin (1994), subsecuentemente reportó que el procedimiento de una extracción similar emparejada con LC- MS- MS, fué capaz de confirmar los compuestos arriba mencionados con la neomicina B y cuatro componentes del complejo de la gentamicina C. el rango de recuperación va desde un 25 % (espectinomicina) al 87% (higromicina B). El método es susceptible a la interferencia de los componentes de la matriz. Estos experimentaron problemas con el punto máximo, el tiempo de retención y con la supresión de iones de los componentes de la matriz. Consecuentemente, usaron muestras de tejido enriquecido como control estándar. Utilizando disociación de colisión inducida (CID), fueron capaces de producir tres iones apareados para la estreptomicina, la dihidrestreptomicina, neomicina B y el complejo de gentamicina C. El CID del ion precursor de (M+H2O+H) al m/z 351 resultó que produce iones muy débiles de m/z 333 y 207 que tienen una abundancia relativa de 4 y 2 % respectivamente. La higromicina B requiere un alto voltaje para alcanzar la fragmentación adecuada. Ellos encontraron que no era posible ajustar el voltaje como una función de m/z, por lo tanto, no es posible efectuar la suficiente separación cromatográfica de la higromicina B de otros componentes para permitir el ajuste del voltaje como una función de tiempo.

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