Metodologia de Aislamiento e identificación de bacterias degradadas de plástico

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Lugar de ejecución

El presente trabajo de investigación se desarrolló de forma parcial en los siguientes ambientes:

• Laboratorios designados para el desarrollo de proyectos de investigación del Programa Profesional de Ingeniería Biotecnológica de la universidad Católica de Santa María en la ciudad de Arequipa, Perú.
• Laboratorios de hospital de la policía ubicado en Av. Cayma xxxx Arequipa, Perú.
• Laboratorios de Labvetsur ubicado en Av. Alfonso Ugarte xxxx, Arequipa, Perú.
• Laboratorios de BIOAL S.A.C ubicado en Av. Tomas Marsano Nro. 3664 Lima, Perú.
• Laboratorios de MacroGen, USA.

1. MATERIALES

• Material Biológico:

En este caso la materia prima de la cual se obtuvo las muestras biologicas fue el plastico degradado por condiciones ambientales en el tiempo.

• Material de laboratorio:

• Tubos de ensayo
• Matraces Erlenmeyer (250, 500ml)
• Pipetas (1, 5, 10ml)
• Probetas (10, 20, 200ml)

• Reacticos y Material Quimico:

• (NH4) SO4 (qp)    
• NaNO3 (qp)          
• K2HPO4 (qp)        
• KCL (qp)            
• MgSO4 (qp)
• Levadura (qp)
• Medio Agar Nutritivo
• Medio Agar Mueller Hinton
• Medio Agar Sangre
• Medio Caldo Nutritivo
• Medio Caldo BHI

• Instrumentación y Equipos:

• Microscopio
• Incubadora
• Mecheros Bunsen
• Placas Petri
• Autoclave

1. Métodos

Obtención y preparación de muestras de plásticos ambiental.

La presente investigación se llevó a cabo mediante el método científico los procedimientos que se detallan a continuación:

Identificación: La muestra fue hallada en la provincia Jorge Basadre en el departamento de Tacna, Perú (UTM) Latitud: -17.3000, Longitud: -70.64978. Se delimitó un área de 1m2 con mayor presencia del “analito” de interés para llevar a cabo el muestreo correspondiente.

Parámetros ambientales: Se determinó y se tomó nota de los parámetros y condiciones ambientales en las que se encontró la muestra. Temperatura 21ºC, Humedad Relativa Promedio 55.15%

Toma de muestra: Se recolectaron con pinzas estériles en recipientes de vidrio esterilizados.

Rotulado y Empaquetado de muestras: Las muestras fueron rotuladas y empaquetadas en bolsas ZipLock, en el rótulo se consideró las condiciones ambientales en las que fue encontrada y la hora de toma de muestra.

Traslado de la muestra: Se trasladaron a la ciudad de Arequipa para su posterior análisis.

Estabilización de la muestra con Suero Fisiológico:

Las partículas de plástico fueron estabilizadas con suero fisiológico en placas Petri de 20ml cada una, previamente esterilizadas. Se separaron en 2 grupos para evaluar el tiempo de exposición.

• Placa 1: 24 horas en contacto con suero fisiológico.

Se depositó los fragmentos de plástico recolectados y 10 ml de suero fisiológico.

• Placa 2: 48 horas en contacto con suero fisiológico.

Se depositó los fragmentos de plástico recolectados y 10 ml de suero fisiológico.

Ambas placas fueron incubadas a temperatura ambiente.

Luego de ser correctamente cerradas y rotuladas se pusieron a buen recaudo y se dejaron reposar a temperatura ambiente por 24 y 48 horas respectivamente.

Preparación de Medios de Cultivo Microbiológico generales para el aislamiento:

Agar Nutritivo: 31g por litro de agua destilada.

Se mezcló y dejó reposar por 5 min, se calentó ligeramente hasta ebullición en agitación constante, dejándolo hervir por aproximadamente 2 minutos. Se llevó al autoclave y se esterilizo a 121ºC durante 15 min. Se dejó enfriar hasta 45ºC aproximadamente y se colocó 20 ml de medio por placas Petri de vidrio de 9 cm de diámetro previamente esterilizadas.  

Se esperó a que las placas enfriaran por completo y se almacenaron a temperaturas de 2ºC a 8ºC.

Agar Mueller Hinton: 37g por litro de agua destilada.

Se dejó embeber por 15 min y se calentó hasta ebullición en agitación constante, dejándolo hervir por aproximadamente un minuto. Seguidamente se llevó a la autoclave y se esterilizo a 121ºC durante 15 min. Se dejó enfriar hasta 45ºC aproximadamente y se colocaron 20 ml de medio por placas Petri de vidrio de 9 cm de diámetro previamente esterilizadas.

Se esperó a que las placas enfriaran por completo y se almacenaron  correctamente a temperaturas de 2ºC a 8ºC.

Sembrado en placa de microorganismo estabilizados:

Las primeras siembras fueron realizadas en medios generales.

Agar Nutritivo:

Agar Mueller Hinton:

En ambos casos las placas se dejaron por un lapso de 7 días.

Evaluación de crecimiento microbiano:

Se seleccionaron las bacterias con potenciales características organolepticas. Color y tamaño de las colonias, bordes irregulares, textura de la colonia, etc.

Sembrado de microorganismos en medios selectivos:

Agar Sangre:

Agar Mac Conkey:

Se dejaron por el mismo lapso de tiempo que los cultivos generales.

Luego se determinaron las características morfológicas de las colonias presentes.

A 7 colonias se les realizaron repiques hasta que se obtuvieron puras en placas diferenciadas facilitando su posterior identificación.

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