Metodologia

Metodología

1. Determinación de los compontes de las aguas residuales

Las muestras de aguas residuales a utilizar se obtienen de la fábrica de dulces “la estrella”, que posteriormente serán analizadas en la comisión nacional de agua (CONAGUA) donde se harán estudios de los parámetros físico-químicos, DBO5 y DQO.

Debido a que A. chroccocum, A. brasilense y G. intraradices no requieren N para el medio de enriquecimiento es necesario identificar la existencia de proteínas en el agua residual por medio del método de biuret y de Bradford.

Para la identificación de carbohidratos se lleva a cabo la reacción de Seliwanoff para la identificación de sacarosa, y la reacción de Benedict para identificar la presencia de monosacáridos, en base a la identificación de grupos reductores libres.

1. Reproducir la cepa de Azotobacter chroccocum, Azospirillum brasilense y glomus intraradices

Los microorganismos a estudiar fueron proporcionados por el instituto de ciencias de la universidad autónoma de puebla (ICUAP) que serán resembrados en los siguientes medios de enriquecimiento:

Azotobacter chroccocum

Como medio de enriquecimiento para azotobacter chroccocum se utiliza agar Ashby.

Azospirillum brasilense

El medio de cultivo usado para el enriquecimiento de Azospirillum spp. es NFb semigelificado y con malato como fuente de carbono.

Glomus intraradices

Para esta cepa en específico, se utiliza medio de cultivo líquido S.O.C. el cual es medio preparado con una solución al 2% de bactotriptona, 0.5% extracto de levadura, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl y 20 mM de MgCl2 6H2O + MgSO4 7 H2O

Conservación de los aislamientos mediante la técnica de criopreservación en Glicerol al 50% (v/v).

1. Neutralización y procesamiento de las muestras de agua

Los microorganismos a utilizar requieren de un pH aproximado de 7.4±0.2, que es el pH óptimo de los microorganismos a estudiar, utilizando NaOH.

Debido a que las aguas residuales se encuentran demasiado concentradas de materia orgánica se utilizaran diluciones de 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9.

1. Preparar distintos caldos de cultivo con la muestra a diferentes concentraciones

Se vierten las distintas soluciones en las cajas de Petri, llevando a cabo ensayos por triplicado para cada microorganismo dando un total de 15 medios nutritivo para cada microorganismo (A. chroccocum, A. brasilense y G. intraradices).

1. Evaluar el crecimiento de los 3 microorganismos en las distintas concentraciones de cultivos

El crecimiento de las bacterias en las fermentaciones se determina por conteo directo de UFC en placas de medio RT. Para llevar a cabo un conteo a las 8 horas de haber inoculado.

Para calcular la concentración se emplea la siguiente fórmula:

[pic 1]

1. En base a los resultados, seleccionar el medio de cultivo y el microorganismo que degrade mayor cantidad del residuo
2. Evaluar la colonización de microorganismos en la raíz de la planta

Se determina el porcentaje de colonización mediante el método de intercepto de McGonigle.

1. Evaluar el crecimiento la planta de maíz con el biofertilizante obtenido

El efecto promotor de crecimiento in vitro por parte de los actinomicetos se evalua en 30 aislados, mediante la producción de indoles totales, a partir del medio B (Strzelczyk, et al., 1984) suplementado con triptona (BT) (anexo E). Esta técnica se basa en la oxidación que produce el ácido sulfúrico en las moléculas de indol, lo que genera una coloración que varía del fucsia al rosado, que permite evidenciar la presencia de moléculas con grupo indol (Celis & Gallardo, 2008). La cuantificación de la producción de indoles, fue desarrollada siguiendo el método propuesto por Glickman & Dessaux en 1995, para esto, se realiza una suspensión de actinomicetos a una concentración de 108esporas/ml a partir de un conteo en cámara de Neubauer.

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