Microbiologia

Introducción a la microbiología

Tinciones, Colorantes, Medios De Cultivo, Técnicas De Aislamiento Y Antibiograma

OBJETIVO

El objetivo de esta investigación es para conocer acerca de las diversas formas que tiene la ciencia para identificar y clasificar a los microrganismos en especial a las bacterias y como es que a través de estos procedimientos se puede encontrar y aislar a las mismas.

TINCIONES

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste entre la célula y el medio que la rodea es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse también para localizar estructuras específicas en la célula o para distinguir entre tipos diferentes de células.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calos es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de la fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce generalmente el encogimiento de las células, la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

Tinciones simples: En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del colorante.

Tinciones diferenciales:

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias

TIPOS DE TINCIONES

Tinción de Gram:

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.

Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las Gram positivas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las gramnegativos se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las gramnegativos son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativos se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativos son rojas mientras que las Gram positivas permanecen en azul.

Deben destacarse dos aspectos cruciales de la tinción de Gram:

 El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.

 La decoloración debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la tinción las células Gram positivas. El proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados son satisfactorios.

El carácter de Gram positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más Gram positivos que otros y algunos son gran variables, es decir, unas veces Gram positivos y otras gramnegativos. La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico.

Cocos Gram positivos Bacilos gramnegativos

Bacilos gramnegativos

Tinción ácido – alcohol resistencia:

Esta tinción sirve principalmente para clasificar mico bacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos mi cólico y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto el ácido – alcohol sensible como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensible de color azul quedando las células ácido – alcohol resistente de color rosa

Tinción de esporas:

Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde del verde malaquita.

COLORANTES

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

SEGÚN SU ORIGEN:

• NATURALES: como la hematoxilina, el carmín y la orceína.

• SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G, etc..

SEGUN SUS PROPIEDADES QUÍMICAS

La mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos.

colorantes ácidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidófilos, porque tienen afinidad por los colorantes ácidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de las proteínas. Estas proteínas pueden pertenecer al citoesqueleto de la célula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al elevado contenido de proteínas del citoplasma la eosina es un excelente colorante citoplasmático. La eosina se une también a las membranas plasmáticas, sin embargo, se desconoce la naturaleza química de esta unión. Las células que presentan un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho retículo endoplasmático liso, etc.) son sumamente acidófilas, o sea, se tiñen intensamente con la eosina.

colorantes básicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan basófilos, porque tienen afinidad por los colorantes básicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al núcleo y ciertas regiones del citoplasma.

Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teñir un tejido se la une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es

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