Microscopia, Colorantes Y Coloraciones

INTRODUCCIÓN:

Colorantes: son sustancias químicas de naturaleza orgánica o inorgánica capaces de transmitir su color a otros cuerpos. Solo alguno de los muchos compuestos orgánicos que actúan como colorante se usa para teñir microorganismos. Se trata de modificaciones de las primeras anilinas de productos del alquitrán, introducidas alrededor de 1980 por koch, weigert y elich en las técnicas bacteriológicas.

Los tres colorantes más comunes usados son fucsina fonicada (una solución de colorante rojo fucsina básica en acido fenico diluido), azul de metileno (generalmente empleando en la forma de azul de metileno alcalino de looffer o azul de metileno policromo) y violeta de genciana o violeta de cristal comúnmente utilizada como violeta de cristal exalato de amonio. Cualquiera de estas soluciones puede ser empleada sola o combinada con otros colorantes y productos químicos, en cualquiera de ellos muchos métodos especiales de tinción. La safranina (rojo pálido) y el pardo de Bismark se emplean a menudo como colorantes de contraste o (contra coloración) para frotis teñidos primeramente con colorantes azul o violeta. El azul de todulina es un colorante especialmente bueno para bacilos de difteria. El colorante de giemsa se utiliza ampliamente para frotis o tejidos de individuos infectados, en quienes se buscan protozoarios o rickettsias. Es un colorante compuesto (neutro), hecho con un derivado de azul de metileno combinado con eosina.

Clases de coloraciones:

1° coloración simple: consiste en utilizar un solo colorante, ya sea un colorante acido o básico. Se caracteriza porque tiñe una solo estructura celular.

2° coloración doble: consiste en utilizar dos colorantes, ácido y básico, y se caracteriza porque tiñe tanto al citoplasma como al núcleo.

3° coloración neutra: consiste en utilizar un solo colorante el que está constituido químicamente por un colorante ácido y un colorante básico. Este tipo de coloración tiñe tanto al citoplasma como al núcleo. Ejemplo: Wright, giemsa

4° coloraciones especiales: son aquellas coloraciones que tiñen determinadas estructuras celulares u organoides citoplasmáticos, utilizando colorantes especiales no poco comunes. Ejemplo: coloración Gram

OBJETIVOS:

 Realizar preparados en fresco y a seco, en forma correcta

 Usar correctamente colorantes: básicos, ácidos y neutros

 Identificar: bacterias, algas, hongos y protozoos

MATERIALES y reactivos:

 Laminas y cubre objetos

 Microscopio

 Mechero

 Algodón, alcohol y fosforo

 Lancetas

Muestras:

 Mucosa labial

 Sarro dentario

 Sangre

Reactivos:

 Violeta de genciana

 Azul de metileno

 Eosina

 Lugol

 acetona

 Aceite de inmersión o de cedro

PROCEDIMIENTO:

1. Muestra: mucosa labial  azul de metileno

1. Coloque la muestra sobre la lámina porta objetos y luego proceda a realizar una extensión o frotis, de tal manera que la distribución sea uniforme, evitando que no queden grumos.

2. Fije la muestra al calor moderado del mechero, al medio ambiente u otros fijadores.

3. Coloca la muestra con un colorante acido o básico de 1 a 3 mins.

4. Lavar la muestra con agua destilada de preferencia o agua corriente. Tratando de eliminar los restos de colorante. El lavado se hace caer por un extremo de la lámina, un chorro de agua de modo que no se desprenda muestra.

5. Secar la lámina al medio ambiente o con el mechero de alcohol al calor moderado teniendo en cuenta que el secado se hace por la superficie inferior de la lámina porta objeto.

2. Muestra: sangre  Wright

1. Coloque una gota de sangre en un extremo de la lámina porta objeto y luego realice un frotis, de tal manera que la muestra quede distribuida uniformemente.

2. Fije la muestra al calor moderado del mechero o al medio ambiente

3. Colocar la muestra con el colorante Wright (al agregar el colorante, se debe contar el número de gotas que se utilizan para cubrir la muestra)

4. De inmediato agregar doble cantidad de agua tamponada con un pH 7 por cada gota de colorante utilizado.

5. Dejar en reposo por 3 a 5 mins

6. Desechar los restos de colorantes que cubren la muestra.

7. Secar al calor del mechero moderado o al medio ambiente

8. Observar en el microscopio compuesto, utilizando el objetivo de inmersión

3. Muestra: sarro dentario  violeta de genciana, eosina y acetona

1. Extensión o frotis

2. Fijación

3. Colorantes violeta de genciana por tres minutos

4. Lavar y secar

5. Añadir Lugol por 2 mins.

6. Alcohol o acetona (hasta decolorar)

7. Lavar y secar

8. Colorante: eosina por 1 mins.

9. Lavar y secar.

10. Observar en el microscopio.

RESULTADOS:

MUESTRA DE SANGRE

Podemos observar con claridad los glóbulos blancos y si observamos a fondo encontraremos glóbulos de tipo; linfocitos que son los que tienen muchas formas globulares coloreadas intensamente, también hay neutrófilos que tienen sedimentos circulares pero en menor cantidad

MUESTRA DE LA SALIVA

podemos observar bacterias del

tipo mastigoforos que

como podemos observar son aquellas que poseen flagelos

MUESTRA DEL SARRO DENTARIO

Bacterias de la clase cocos, y son conocidos como estreptococos por forman largas cadenas de cocos. Y también podemos observar ciertos bacilos que son aquellas que tienen formas redondeadas.

CONCLUSIONES:

 Concluimos en que el uso de las tinciones mediante los colorantes son muy importantes ya que nos permiten diferenciar las estructuras internas de un microorganismo sea así citoplasma o núcleos

 El microscopio es vital en este campo de estudio ya que de nada servirían las técnicas de tinciones si no hubiera forma alguna de poderlas observar

BIBLIOGRAFÍA:

 http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto

 www.cecyt6.ipn.mx/academia/BASICAS/BIOLOGIA/micro1_archivos/image002.jpg&imgrefurl=http://www.cecyt6.ipn.mx

 http://es.scribd.com/doc/15024971/Cap-5-Coloraciones

 http://html.rincondelvago.com/tinciones-hematologicas.html

 http://www.ht.org.ar/histologia/NUEVAS%20UNIDADES/unidades/Unidad1A/clasific.htm

 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué diferencias hay entre un preparado en seco y un preparado en fresco?

 Preparados fijos o en seco: son los que se hacen en un momento determinado y, como su nombre lo indica, se "fijan" al portaobjetos para ser observado en cualquier otro momento. No todos las células o tejidos pueden ser fijados pero, cuando puede hacerse (y cuando tiene sentido), tiene la ventaja de que no se deterioran con el tiempo

 Preparados frescos: el que hacemos en el momento. El problema de estos preparados es que se deshidratan rápidamente y se arruinan.

Entonces podríamos decir que:

 Una de las diferencias es el proceso por el que pasa la muestra antes de ser observada siendo este su modo de preparación y fijación,

 También que la muestra en seco es mucho más duradera que la muestra en fresco ya que una vez fijada la muestra, podemos tenerla por mucho tiempo sin que esta pierda su estructura o la función que tenemos por estudiar, en cambio la de fresco tiende a deshidratarse muy rápido y se hace más tedioso para su estudio ya que el campo de visión cambia.

2. ¿Qué es colorante? ¿Cuál es el fundamento de una coloración neutra?

Los colorantes son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo que otorga color a la molécula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electro-líticamente y por lo tanto formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.

Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintéticos. Los colorantes naturales son utilizados principalmente con fines histológicos. La mayoría de las tinciones bacterianas son realizadas con colorantes sintéticas, en su mayoría anilinas, las cuales derivan del benceno.

Coloración neutra: Es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos colorantes ácidos y básicos.

Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la eosina como colorante ácido.

De este modo, obtenemos una tinción diferencial, es decir, una tinción que es capaz de

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