Métodos Microbiológicos

Métodos Microbiológicos (Ref. #1)

 Pruebas de sensibilidad antibiótica

Las técnicas ordinarias de difusión para la determinación de la sensibilidad a los antibióticos de organismos aislados de especímenes clínicos han sufrido las dificultades de estandarización. No obstante las técnicas han sido mejoradas de manera constante.

La técnica de difusión clásica exige que se aplique una fuente del agente antimicrobiano a la superficie de un medio solido. La difusión del agente a través del medio inhibe el crecimiento de un organismo sensible que crezca en o sobre de él hasta un grado determinado parcialmente por la receptividad del organismo. Sin embargo se sabe que un cierto número de otros factores pueden afectar el tamaño de las zonas de inhibición y que estos factores deben ser controlados.

Los factores que afectan el tamaño de las zonas de inhibición son:

 Los componentes de la zona de cultivo: las peptonas, triptonas, extractos de levadura y agar. Pueden variar en su contenido mineral y se sabe perfectamente que el calcio, el magnesio y el hierro modifican el tamaño de las zonas de inhibición, disminuye la actividad de los aminoglicósidos y aumenta el efecto del ácido fusídico. Los carbohidratos pueden aumentar la acción de la furantoína o de la ampicilina. Las dos sustancias que se sabe ocasionan una disminución en la zona de inhibición son la p-aminobenzoico y la timidina (componentes de algunos medios de cultivo).

 Elección del medio: se obtienen resultados consistentes y reproducibles cuando se utilizan medios ideados especialmente para ensayos de sensibilidad (agar de Mueller-Hinton). De manera ideal, las placas deben llenarse en posición horizontal, con un espesor uniforme del medio por toda la placa. No dan buenos resultados las placas muy delgadas o muy gruesas.

 Efecto del pH: la actividad de los aminoglicósidos se ve aumentada en un medio alcalino y disminuida en medios básicos. Para las tetraciclinas el efecto es inverso. El dióxido de carbono en la atmósfera de la estufa o la presencia de carbohidratos fermentables en los medios de cultivo pueden también inducir condiciones ácidas.

 Tamaño del inóculo: las siembras densas disminuyen en algún grado las zonas de inhibición. El inóculo ideal es el que da lugar a un crecimiento uniforme y denso sin ser confluente.

Los cultivos en caldo y las suspensiones adecuadas del germen en medios sólidos pueden diluirse exactamente para obtener un inóculo óptimo. En la práctica pueden obtenerse buenos resultados tomando un asa de cultivo bien desarrollado o haciendo una suspensión adecuada del organismo y extendiéndolas con un hisopo estéril seco.

 Pruebas de sensibilidad directa: las pruebas de sensibilidad pueden realizarse sobre cultivos primarios, estás pruebas permiten dar un informe con 24 horas de anticipación. Las colonias semejantes sobre los medios de cultivo primarios pueden presentar poblaciones claramente diferentes. Es de esperarse que exista la posibilidad de que se esté trabajando con un cultivo mixto en el que se encuentre un organismo productor de penicilinasa que “proteja” a otros gérmenes sensibles contra la acción de un antibiótico que sea sensible a la penicilinasa. Los estafilococos productores de penicilinasa se reconocen por lo general por que los bordes de las zonas de inhibición que producen no muestran tendencia a producir colonias más pequeñas en la proximidad del disco y son apiladas y puntiagudas. Por ello, “cualquier germen importante que se halle presente en compañía de un productor de penicilinasa debe subcultivarse y llevarse a cultivo puro”.

 Ejecución de las pruebas de difusión

Concentración de antibióticos

Actualmente hay poco acuerdo en relación con la concentración de los discos de antibióticos a utilizar en los ensayos de sensibilidad in vitro. Se dispone de tablas que proporcionan las concentraciones recomendadas en los discos, que varían de acuerdo con el método de interpretación que se va a utilizar.

Conservación y aplicación de los discos

Las condiciones de conservación son muy importantes si se han de obtener resultados reproducibles. Los discos deben conservarse siempre en lugar fresco y seco y deben aplicarse con presión al medio para asegurar un contacto adecuado y por tanto una difusión uniforme. Para ello deben emplearse unas pinzas de puntas finas y aguja de disección.

Tiempo de incubación

De manera ideal el tiempo de incubación debe ser el mínimo requerido para el crecimiento del organismo (24hrs a 37°C) y de acuerdo con la rutina diaria del laboratorio. La incubación prolongada puede determinar la destrucción del antibiótico y el crecimiento posterior de los organismos a lo que se ha impedido la multiplicación, pero no han sido muertos.

Técnica de kirby-Bauer

Se utiliza agar Mueller-Hinton en placas de 5-6 mm de grosor para discos de contenido elevado. Se aplican con hisopos de algodón hidrófilo (de garganta) inóculos cuidadosamente estandarizados para que den un crecimiento confluente. Se leen los diámetros de zona y se consultan las tablas que indican el punto de rotura para el antibiótico. Si no se reproducen las condiciones exactas de la prueba, las tablas pueden obtenerse en el mismo laboratorio. La sensibilidad de un germen se indica como sensible, intermedia o resistente.

Recuento de microorganismos viables tras diluciones seriadas

Una simplificación sencilla para el recuento bacteriano la ofrece la estandarización de McFarland, útil en análisis microbiológicos sencillos La escala de McFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato bárico con el número de bacterias presentes en una muestra. La turbidez producida por cada mezcla de BaCl2 y H2SO4 ha sido calibrada para aproximar un cierto número de bacterias por unidad de volumen. En otras palabras, la turbiedad que resulta al agitar bien una de estas probetas se aproxima a la turbiedad producida por un cierto número de bacterias en suspensión.

Escala de McFarland

BaCl2 1% (mL)

H2SO4 1% (mL) No. Aproximado de bacterias representado ×106UFC/mL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

Determinación de la sensibilidad de una bacteria a agentes antimicrobianos: antibiograma (Ref. #2)

Existe una gran variedad de agentes antibacterianos, susceptibles de ser empleados en el tratamiento. Los quimioterápicos son productos químicos dotados de actividad antimicrobiana, presentan una reducida toxicidad. El término antibiótico se reserva para los quimioterápicos naturales producidos por microorganismos. Todas las bacterias no presentan la misma sensibilidad a los distintos antibacterianos, de ahí la importancia de realizar estas determinaciones. Las pruebas más utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano están basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente.

La sensibilidad de una bacteria a un antibiótico determinado viene dada por la concentración mínima inhibitoria (CMI), que se define como la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una sepa bacteriana dada. Los resultados obtenidos pueden ser interpretados y trasladados a las categorías cualitativas de sensible (S), intermedio (I) o resistente (R) según sea el tamaño del halo de inhibición (según la concentración del antibacteriano).

El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la que se enfrenta la bacteria, inoculada sobre la superficie de un medio con agar a una solución antibiótica absorbida por discos de papel filtro o pastillas. Este método fue estandarizado por Bauer en 1966. Este estudio dio lugar al método de Kirby-Bauer, que es el recomendado por la Food and Drug Administration (FDA) y el National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), aunque con ligeras modificaciones.

El medio de cultivo más frecuentemente usado es el de Mueller-Hinton, el pH del medio debe estar entre 7.2 y 7.4, y el grosor entre 4 y 6 mm. Los discos de antibióticos son adquiridos comercialmente, aunque también pueden ser preparados, deben contener la cantidad establecida de antibiótico y ser conservados a 4°C protegidos de la humedad.

El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0.5 de la escala de McFarland, aproximadamente 108 UFC/mL, y se prepara en solución salina estéril o caldo de cultivo. La inoculación se puede efectuar con un hisopo de algodón estéril.

Las placas se deben incubar a 37°C en la atmósfera adecuada. La lectura se debe realizar entre 18 y 24 horas.

 Procedimiento

1. Preparar cultivos de 18 horas de las bacterias en agar tripticasa soja (TSA).

2. Inocular una porción de una colonia en 5 mL de solución salina estéril resuspendiéndola hasta lograr la turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland.

3. Utilizar un hisopo de algodón para tomar el inóculo: sumergirlo en la suspensión y eliminando el exceso de suspensión.

4. Inocular la superficie de una placa de agar de Mueller-Hinton con el hisopo pasándolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones.

5. Colocar los discos de antibióticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y ejerciendo leve presión contra la superficie del agar. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a difundirse los antibióticos.

6. Incubar la placa en posición invertida a 37°C durante 24 horas.

7. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con un calibrador.

8. Los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de sensible (S), intermedio (I) o resistente (R).

Método de extracción de aceites esenciales (Ref. #3; web)

 Técnica de destilación por arrastre de vapor

En la destilación por arrastre de vapor de agua se lleva a cabo la vaporización selectiva del componente volátil de una mezcla formada por éste y otros "no volátiles". Lo anterior se logra por medio de la inyección de vapor de agua directamente en el interior de la mezcla, denominándose este "vapor de arrastre", pero en realidad su función no es la de "arrastrar" el componente volátil, sino condensarse en el matraz formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la mezcla a destilar para lograr su evaporación. En este caso se tendrán la presencia de dos fases insolubles a lo largo de la destilación (orgánica y acuosa), por lo tanto, cada líquido se comportará como si el otro no estuviera presente. Es decir, cada uno de ellos ejercerá su propia presión de vapor y corresponderá a la de un líquido puro a una temperatura de referencia.

La condición más importante para que este tipo de destilación pueda ser aplicado es que tanto el componente volátil como la impureza sean insolubles en agua ya que el producto destilado volátil formará dos capas al condensarse, lo cual permitirá la separación del producto y del agua fácilmente.

REFERENCIAS

(1) Bradshaw, L.J. (1976). Microbiología de laboratorio. México: El manual moderno S.A.

(2) Gamazo, C. (2005). Manual práctico de microbiología. 3ra ed. Barcelona, España: Masson.

SITIO WEB

(3) http://www.depa.fquim.unam.mx/~tunda/metodosdets.htm

...