Nutricion Microbiana Y Requerimentos D Oxigeno

OBJETIVOS

Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

Explicar el fundamento de la técnicas más utilizadas en el recuento microbiano: microscópico, dilución y siembra en placa o tubo; filtración y siembra en placa, reducción de indicadores óxido-reducción.

Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de las técnicas más adecuadas.

Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de éstos.

Explicar el concepto microbiológico de indicador de contaminación.

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante el recuento de mesófilos aeróbios y la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.

RESULTADOS

MÉTODO REDOX (REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO).

Cuadro 1. Imágenes de método redox

Imagen Descripción

Perdió la coloración azul a los 10 min por lo que se considera de muy mala calidad.

Perdió casi toda la coloración después de 5.5 hrs, pero aún se distingue el color azul, por lo que se considera de excelente calidad

MÉTODO DE DILUCIÓN Y VERTIDO EN PLACA

Muestra: Tierra de jardín

Medio de cultivo empleado: Triptona glucosa extracto de levadura.

Cuadro 2. Numero de colonias de cada dilución y repetición

Repetición Dilución

10-5 10-6 10-7

A 103 72 51

B 128 209 99

X 116 141 75

X=Promedio de las UFC de ambas repeticiones.

Cuadro 3. Imágenes de las diluciones, repeticiones y control

Imagen Descripción

Control y diluciones 10-5.

No se observa repetibilidad en el desarrollo de la dilución.

Control y diluciones 10-6.

No se observa repetibilidad en el desarrollo de la dilución.

Control y diluciones 10-7.

No se observa repetibilidad.

Cálculo de UFC/g suelo:

Se calcula a partir del promedio los resultados obtenidos en la dilución 10-7 (30-300 colonias).

UFC/(g suelo)=(75 UFC*〖10〗^7)/(1mL suspensión)×(100mL suspensión)/(10g suelo)=1.7×〖10〗^9 UFC⁄(g suelo)

MÉTODO DE FILTRACIÓN

Muestra: agua de llave de jardín.

Medio de cultivo empleado: ENDO

Cuadro 4. Placa de siembra con membrana millipore

Imagen Descripción

Colonias incontables de coliformes

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

Muestra: Hielo de raspado

Cuadro 5. Cantidad de tubos positivos en los diferentes medios.

Medio de cultivo Tubos positivos No. de microorganismos*

Caldo lactosado 5

Caldo bilis verde brillante 2 Coliformes totales:

2.6 NMP /100 mL de muestra

Caldo EC 0 Coliformes fecales:

0 NMP/100 mL muestra

CCAYAC-M-004 (2006). Estimación de la densidad microbiana por la técnica del NMP, detección de coliformes totales y coliformes fecales y E. coli por NMP (COFEPRIS).

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES

Prueba confirmativa para Escherichia coli

Medio de cultivo empleado: Agar EMB (para aislamiento a partir de caldo verde brillante).

Cuadro 6. Imagen del desarrollo microbiano en medio EMB.

Se observan colonias verdes con brillo metálico.

Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas IMVIC (Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato).

Medio de cultivo empleado: Agar Cuenta Estandar (a partir del cual se hizo la suspensión para las pruebas IMVIC).

Cepa de referencia. E.aerogenes.

Cuadro 6. Resultados de las pruebas bioquímicas IMVIC.

Prueba Resultado obtenido del desarrollo en Agar Cuenta Estandar (muestra de agua) Reportado en la literatura para E.coli (MacFaddin, 2003) E. aerogenes Reportado en la literatura para E. aerogenes (MacFaddin, 2003)

RM - + - -

VP - - - +

SIM Sulfhidrico - - -

Indol - Variable + (70-90%) - -

Movilidad + + + +

Citrato de Simmons + - + +

OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO

Fecha: 28/10/13

Muestra: Enterobacter aerogenes

Tinción: Gram

Preparación: Fija

Aumento: 100x

Descripción: Bacilos Gram (-) sin agrupación definida.

Fecha: 28/10/13

Muestra: Desarrollo en Agar Cuenta Estandar.

Tinción: Gram

Preparación: Fija

Aumento: 100x

Descripción: Cocobacilos Gram (-) sin agrupación definida.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Existen diversos métodos que permiten cuantificar a los microorganismos de una determinada muestra, y pueden ser directos o indirectos. Con los métodos directos, se establece la población total de microorganismos en la muestra (vivos y muertos), mientras que con los métodos indirectos, se hace un recuento de células viables[1]. Una célula viable es aquella capaz de dividirse y originar descendencia, y en la mayoría de las situaciones, éstas son las que interesan (Madigan, 2009).

En ésta práctica se emplearon únicamente métodos indirectos: el método redox, método de dilución y vertido en placa, filtración y método del número más probable, que fueron los empleados en ésta práctica.

El método redox nos permitió estimar el número aproximado de microorganismos por mililitro de dos muestras de leche, una bronca y una pasteurizada (Alpura 2000). Es un método indirecto basado en la reducción del colorante azul de metileno, que es un indicador oxido-reducción de color azul en su forma oxidada e incoloro en su forma reducida. La actividad reductora de los microorganismos (debida a enzimas reductasas) se manifiesta por el tiempo de la reducción del colorante a 37°C aproximadamente [2]. En el caso de la leche bronca, una vez añadido el azul de metileno a una muestra de la misma, se decoloró en menos de 20 minutos, lo que indica que hay más de 20 millones de microorganismos por mililitro de leche presentes y que la calidad de la leche bronca empleada es muy mala. Esto es coherente, pues para que la leche se haya decolorado en un tiempo relativamente corto, se necesita de una gran cantidad de microorganismos que estén ejerciendo una actividad reductora sobre el colorante. Por otro lado, la leche pasteurizada Alpura 2000, perdió la coloración impartida por el azul de metileno en más de 5.5h, quedando incluso aún una pequeña porción de leche que todavía se encontraba de color azul, lo que indica que el número aproximado de microorganismos presentes en ésta leche es de menos de 500 000/mL, y que la calidad de la leche es excelente.

Éste método no representó dificultad para llevarlo a cabo, sin embargo, no nos permite tener un mejor conocimiento sobre cuántos microorganismos están presentes en la muestra, sólo nos permite hacer una estimación, que, si bien puede ser suficiente para determinar la calidad de la leche, en comparación con los demás es poco exacto.

El método de dilución y vertido en placa se empleó para cuantificar los microorganismos presentes en una muestra de suelo. Éste método mide el número de células viables y los recuentos en placa se basan en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia, por tanto, los resultados que se obtienen suelen informarse como UFC (unidades formadoras de colonia). La convención de la Food and Drug Administration de E.U. es que se cuenten las placas con 25 a 250 colonias, si bien muchos microbiólogos prefieren placas con 30 a 300 colonias. Para asegurar que algunos recuentos estén dentro de éstos límites se hace una dilución seriada de la muestra (Tortora, 2007). El desarrollo obtenido en las placas con diluciones 10-5, 10-6 y 10-7, nos indica que no hay repetibilidad, pues las dos placas con cada dilución, difieren bastante en el número de microorganismos, además, tampoco se observa efecto de dilución, pues el número de microorganismos entre una placa y otra no cambia significativamente, incluso, en la repetición B, la dilución 10-6 tiene un mayor número de microorganismos que la dilución 10-5. Esto lo atribuímos principalmente a que la cantidad de muestra tomada en cada dilución pudo no ser exacta.

Por otro lado, la placa usada como control, en la que no se inoculó el microorganismo, no presentó desarrollo microbiano, lo que nos habla de un buen manejo de la técnica aséptica y es el único factor de confiabilidad de los resultados obtenidos con éste método, pues al no haber repetililidad ni efecto de dilución, los resultados son poco confiables. Pese a ello, Se realizó el cálculo y se obtuvo como resultado 1.7×〖10〗^9 UFC⁄(g suelo). Ésto nos habla de que en la muestra de suelo analizada, hay una gran cantidad de microorganismos, lo cual es de esperarse al tratarse de una muestra de suelo de jardín, pues hay gran disponibilidad de nutrientes en el.

Cabe mencionar que éste procedimiento tiene como desventaja que requiere de 24h o más para que se desarrollen colonias visibles en la placa y éste a su vez está sujero al tiempo de incubación. Además, debe considerarse que no todos los microorganismos crecen con la misma velocidad y que hay microorganismos sensibles al calor que pueden resultar dañados por el agar fundido (para el vertido en placa) y por consiguiente sean incapaces de formar colonias. También,

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