PPO ( Polifenol Oxidaza) Pardeamiento

ESCUELA POLITECNICA NACIONAL

INGENIERÍA QUÍMICA

CATEDRA DE BIOQUIMICA

Prof: Patricio Castillo, Phd Fecha: 27-05-2014

Nombres: Valeria Arias, Josue Lindao, Pablo Tamayo, Mario Tupiza.

TEMA: ACTIVIDAD ENZIMÄTICA DE LA PPO

1.- INTRODUCCIÓN:

La actividad enzimática de la Polifenol Oxidasa es aquella la cual provoca el oscurecimiento o pardeamiento de las frutas y vegetales, lo que causa una gran pérdida económica, en el comercio de estos productos debido a que este pardeamiento provoca una disminución en propiedades de la fruta tales como: sabor, color, aroma, contenido nutritivo, etc. Por este motivo los estudios de la inhibición de esta enzima son muy amplios, y con un sin número de experimentaciones con distintos tipos inhibidores. En el presente trabajo se ahonda en las características principales de la PPO, tales como su estructura y distintos tipos de reacción que puede sufrir, la inhibición de la enzima así como también su mecanismo de inhibición. Su extracción y purificación en conjunto con sus aplicaciones. La investigación científica en este campo crea una necesidad de tipo económico-industrial, puesto que anualmente hay producto que se pierde solo por esta actividad enzimática, asi buscando una inhibición más eficiente se podría disminuir pérdidas aumentando el tiempo de vida de las características de las frutas y vegetales.

2.- POLIFENOL OXIDASA (PPO)

La PPO son enzimas las cuales se encargan de catalizar el pardeamiento enzimático y coloración de las frutas y vegetales, este tipo de enzimas pertenecen a las óxido-reductasas. La PPO es conocida como fenoloxidasa, monofenol oxidasa, difenol oxidasa, catecolasa, tirosinasa y fenolosa; este último nombre es el más aceptado y su nombre corresponde a la o-difenol-oxigeno-oxido-reductasa, usualmente llamada PPO. Estas enzimas se encuentran localizadas principalmente en el citoplasma de las células (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.6). Fueron descubiertas y aisladas inicialmente en los champiñones. La PPO actúa sobre dos tipos de sustratos: monohidroxifenoles como el p-cresol hidroxilandolos en posicion orto con respecto al grupo hidroxilo original y sobre odihidroxifenoles tales como el catecol, oxidándolos a benzoquinona por remoción de hidrógenos del grupo hidroxil como se puede ver en la fig No 1. (Guerrero, p 15) Llamando así a sus 2 clases de actividades enzimáticas: la actividad cresolasa cuando hidroxila monofenoles y la catecolasa cuando oxida difenoles a quinonas. La actividad cresolasa es mayor o menor, incluso hasta inexistente en algunos casos pero por lo general todas las enzimas tienen actividad catecolasa. (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.7)

La forma de actuación de la enzima cataliza dos reacciones debido a que en su estado nativo se encuentra en dos formas distintas: la llamada met-tirosinasa, que es activa solamente sobre monofenoles, y la oxi-tirosinasa. Estas formas se interconvierten entre ellas, de forma acoplada al desarrollo de la reacciones que catalizan (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.7)

Fig No1.- Reacción generalizada de la PPO en plantas

La principal característica estructural de la PPO es la presencia en un centro activo de 2 átomos de cobre Cu1+ que se encuentran unidos cada uno de ellos a 2 o 3 histidinas y que en su entorno se sitúa una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos, que son muy importantes en su actividad, para la unión de los sustratos como se puede observar en la Fig No2(Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.8).

Los centros activos presentan una estructura piramidal trigonal y el átomo de azufre de la cisteína 92 no se liga al centro activo del cobre este está unido pero covalentemente al átomo del carbono de la histidina 109 (Guerrero, p 16).

Existe una alta heterogeneidad entre especies y dentro de la misma especie con el fin de expresar la actividad de la PPO la cual puede variar dependiendo de ciertos factores como: pH óptimo, latencia, especificidad por el sustrato, etc. (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.8).

Fig No2.- Geometría de los centros activos de la PPO

3.- INHIBICION DE LA PPO:

Los primeros estudios realizados acerca de la actividad de la PPO fueron realizados por James K Parmer de la United Fruit Company en donde se planteó algunas propiedades de la PPO y se compara con otras fuentes vegetales de esta enzima. Desde ese momento existe una gran cantidad de investigación acerca de como inhibir el pardeamiento enzimático en particular para frutas y hortalizas. Por ende se han probado muchos tipos de inhibidores como: dopamina, ácido clorogenico, catecol, dopa, ácido ascórbico, ácido cítrico, cloruro de sodio, cisteina, 4-hexilresorcinol. Buscando otras alternativas se han usado de sulfitos, tioles , cuminadehido, extractos vegetales y técnicas combinadas como atmosferas controladas, ácido ascórbico y EDTA. (Guerrero, p 16)

3.1.- Para la inhibición de la PPO se han probado metodos físicos y químicos:

En los métodos químicos la actividad de esta clase de inhibidores implica una interacción directa con la enzima o reacción preferiblemente con el producto que conduce por reacción no enzimática a la formación de pigmentos oscuros. (3) Se ha adicionado sustancias químicas para ajustar las condiciones de pH, por exclusión de oxígeno.( Guerrero, p 17)

La utilización de métodos físicos es una alternativa a la de métodos químicos ya que son considerados gran parte de ellos como perjudiciales para el hombre y el medio ambiente. Aplicando métodos físicos como la refrigeración y procesos térmicos, además de tecnologías emergentes como los campos eléctricos pulsados, altas presiones hidrostáticas, rayos Gamma.( Guerrero, p 17)

Los tratamientos por calor o frio para la inhibición de enzimas causan sobre las frutas y hortalizas efectos adversos tales como la pérdida de color, alteraciones en su sabor, olor y pérdida de su valor nutricional. (Guerrero, p 17)

Estos métodos de control pueden dividirse en tres tipos dependiendo del factor al que ataquen como son a la enzima, a los sustratos y a los productos:

3.1.1.-- Acción sobre la enzima:

La acidificación, alcalinización y tratamientos térmicos son frecuentemente aplicados para inhibir la actividad enzimática. En el caso de la alcalinización no puede ser aplicada a compuestos fenólicos debido a su alta sensibilidad a la oxidación a pH alcalinos. La PPO muestra su actividad óptima a un pH entre 5 y 7 y la enzima parece relativamente sensible a pH ácidos. Pero, el control del pardeamiento enzimático por acidificación es muy difícil, a menos que sea a pH muy bajos. (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.10)

3.1.2.-Acción sobre los sustratos:

Cuando existe una remoción completa del oxígeno resulta una forma muy satisfactoria para el control de la oxidación fenólica catalizada por la PPO pero este método no puede ser aplicado a tejidos vivos porque puede causar condiciones anaeróbicas y tampoco es aceptable en algunos productos frescos.

En tanto a los sustratos fenólicos se han investigado 2 opciones. La primera es la eliminación física por adsorbentes específicos como la ciclodextrina. La segunda forma de remoción de compuestos fenólicos es por su modificación enzimática a través del uso de o-metil-transferasa. (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.10)

3.1.3.-Acción sobre productos

Las o-quinonas pueden ser reducidas a o-difenoles o pueden reaccionar con otros compuestos y formar complejos no coloreados. Algunos de los compuestos reductores más usados son: el ácido ascórbico, los sulfitos, los tioles como la cisteína y los aminoácidos. (Garzon, Rojano, Guerrero, ,p.10)

4.- INHIBIDORES ENZIMATICOS DE LA POLFENOL OXIDASA

Agentes reductores. Previenen el pardeamiento enzimático por la reducción de o-quinonas a o-difenoles no coloreados. Los compuestos derivados del azufre son los más ampliamente empleados en la industria alimentaria. Encontramos al ácido ascórbico y la cisteína, la cual tiene efectos negativos sobre el sabor.

Acidulantes. Los acidulantes son aplicados generalmente para mantener el pH por debajo del punto óptimo de actividad catalítica de la enzima. Acidulantes como el ácido cítrico, málico y fosfórico pueden inhibir el efecto de la PPO. Los acidulantes son usados frecuentemente con otros antioxidantes.

Quelantes. Las enzimas generalmente poseen iones de metales en su centro activo. Los agentes quelantes remueven estos iones inactivando a la enzima.

Agentes acomplejantes. La más importante propiedad funcional de la ciclodextrina como agente acomplejante es su habilidad para la inclusión de moléculas dentro del núcleo hidrofóbico o ligeramente apolar, convirtiéndose en un excelente inhibidor de pardeamiento en frutas frescas y vegetales crudos.

Inhibidores de enzimas. El 4-hexilresorcinol, es un compuesto m-difenolico que esta estructuralmente relacionado con los sustratos fenólicos, tienen un efecto inhibidor competitivo con la PPO. Este es efectivo a bajas concentraciones, tiene estabilidad química, y presenta alto sinergismo con el ácido ascórbico mientras reduce las quinonas. (Guerrero, p 22)

4.-1.- Isoespintanol como antioxidante

Los antioxidantes naturales en alimentos, pueden provenir de compuestos endógenos de uno o más componentes del alimento, de sustancias formadas de reacciones durante el procesamiento o de aditivos alimenticios aislados de fuentes naturales. La mayoría son compuestos fenólicos presentes en todas las frutas y vegetales

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