Practica 1 Lmffl - Esterilización de Material de Vidrio y Preparación de Medio de Cultivo LB Liquido

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Introducción

Al trabajar con microorganismos se sabe que el número de variables y factores que pueden afectar los resultados de las prácticas, son mayores que cuando se realizan experimentos con elementos sin vida y por esto es por lo que se deben de llevar acabó ciertos protocolos de limpieza, esterilización y desinfección tanto en los materiales como en el área de trabajo. El proceso de esterilización se lleva a cabo en los procedimientos quirúrgicos y en los laboratorios de microbiología. En este último, esterilizar es de vital importancia para poder analizar, estudiar y observar gérmenes puros, eliminando cualquier tipo de vida microbiana que no se quiera observar. Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con material y medios de cultivo estériles. Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La composición de los medios de cultivo varía en función del grupo microbiano que se pretende estudiar, y la preparación del medio depende de la complejidad química (composición), el estado físico y otras condiciones requeridas (pH, concentración, etc.). (Bermúdez, 2020) En Microbiología la esterilización se define como “el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos medios esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico). El método a elegir dependerá del material a esterilizar y del equipo e instalaciones disponibles. Con los objetos de acero inoxidable y de vidrio podemos usar cualquier método, pero en el caso de los materiales plásticos debemos tener en cuenta su composición para evitar deformaciones e incluso la destrucción del material. (López, 2020) El método físico más ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo ó seco, los cuales tienen diferente penetrabilidad. Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se producen efectos letales en los microorganismos. La muerte de las bacterias por el calor es consecuencia de la desnaturalización de sus Proteínas. Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de Hidrógeno), de las proteínas de los cuales depende su funcionalidad son más lábiles cuando las proteínas están hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el “calor húmedo” es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros componentes proteicos importantes para la célula que el “calor seco”. (ITESO,2019)

Objetivos

• Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.
• Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo.
• Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
• Conocer los diferentes métodos que garantizan la esterilización del material empleado en el laboratorio.
• Preparar medios de cultivo con diferente estado físico y explicar la diferencia en el procedimiento de preparación.

Procedimiento

Conclusión

Actividad 1. Esterilización del material de vidrio: antes de entrar de lleno con esta primera actividad es necesario realizar la limpieza del área de trabajo, esa limpieza se hará con el propósito de eliminar el material extraño (como polvo o tierra) de la superficie, también se eliminaran los microorganismos que pudieran encontrarse sobre la superficie, esta limpieza deberá realizar con agua, jabón o detergente, aunque para limpiar esto será suficiente, en circunstancias ideales podría hacerse uso de un limpiador químico. (Rodríguez Pérez, Delgado Pérez, & Dujarric Martínez, 2007)

Una vez limpia la zona donde se estará trabajando se puede pasar a limpiar el material con el que se estará trabajando, primero se limpia con etanol al 70%, al ser un alcohol podemos clasificarlo como un desinfectante de mediano nivel, que, aunque no destruye esporos si destruye gérmenes como M. tuberculosis, hongos y virus no lipídicos, su mecanismo de acción se basa en producir precipitación y desnaturalización de proteínas, es importante recordar que la concentración debe ser entre 60% y 80% en agua destilada, siendo la preparación más efectiva al 70%, ya que si la concentración es menor al 60% se perdería el efecto desinfectante. (Vignoli, 2006)

Posterior a la desinfección con alcohol se deberá enjuagar el material con agua destilada, es muy importante que el agua sea destilada ya que al pasar por el proceso de destilación se están eliminando todo tipo de impurezas como minerales y microorganismos, de esta forma estamos garantizando las condiciones estériles del material en cuestión.  Después se dejará escurrir el material, es importante recordar que no es aconsejable secar los artículos de vidrio con toallas, aire forzada, o alguna técnica parecida, ya que de esta forma podrían introducirse impurezas que terminaran contaminando el material. (www.greelane.com, 2018)

Una vez que el material se ha escurrido se secara por calor seco a 80°C durante 1 hora; esta técnica provocara la desnaturalización de proteínas, lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, la acción letal es el resultado del calor transmitido desde el material con el cual los microorganismos están en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea (como pasa con el calor húmedo). (Vignoli, 2006)

Una vez terminado el proceso de calor seco, se preparará el material para ser esterilizado en autoclave, se elaboraran tapones para los matraces y pipetas, además se envolverán en papel estraza que a su vez será marcado con cinta testigo, una vez hecho esto se esterilizara en autoclave por 15 minutos a 120°C y 15 psi; este tipo de esterilización entra en la clasificación de calor húmedo, proceso que destruye microorganismos en forma gradual y que logra desnaturalizar y coagular proteínas, es muy importante cumplir con la temperatura y tiempos (de 15 a 20 minutos) especificados ya que solo así se lograra la temperatura y presión de una atmosfera relativa, lo que a su vez provocara el aumento proporcional en el punto de ebullición del agua, el cual permitirá la destrucción microbiana efectiva, logrando así la esterilización. (Vignoli, 2006)

El uso de la cinta testigo en la esterilización es muy importante ya que no solo servirá para pegarse (ya que tiene una excelente adhesión) y escribir sobre ella, su propósito va más encaminado en comprobar que el proceso de esterilización con vapor se ha llevado a cabo, ya que su color cambiara de blanco a negro al ser sometida al proceso de esterilización. (gke, 2017)

Actividad 2. Preparación del medio líquido y sólido.

Actividad 2.1. Preparación de 50 mL de medio LB sólido sin antibiótico: Antes de preparar el medio se tendrán que realizar los cálculos pertinentes para conocer las cantidades a utilizar, este punto es importante porque de la preparación del medio dependerá el éxito del mismo, ya que a través de las cantidades lograremos obtener la consistencia apropiada, así como los nutrientes que requerirá el microorganismo o microorganismos a cultivar en el mismo, en este caso fueron suficientes algunas reglas de tres para así obtener los valores de X que en este caso fueron: 0.5gr de peptona de carne, 0.25gr de NaCl, 0.25gr de extracto de levadura y 0.15gr de Agar; estos se mezclaron con agua destilada (debe ser destilada por la razones explicadas en el párrafo 3, de la actividad 1 del apartado de conclusión), después se adiciona el reactivo, el cual se disolverá para después aforar el matraz, una vez que el medio de cultivo se ha preparado se tapara adecuadamente el matraz que lo contiene y se pegara un pedazo de cinta testigo (por las razones explicadas en el párrafo 6, de la actividad 1 del apartado de conclusión).

Una vez realizado todo lo anterior se meterá el matraz a esterilizar en autoclave por 15 minutos a 120°C a 15 psi, como se mencionó anteriormente este calor húmedo provocara en las células la desnaturalización de proteínas y fusión de lípidos de membrana debido a la ruptura de muchos enlaces débiles, en especial los puentes de hidrogeno entre grupos C=O y H-N, la inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua, nos permitirá deshacernos de la mayoría de las células vegetativas de bacterias, levaduras y hongos, hasta de esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos. (MICROBIOLOGÍA GENERAL, 2019)

Una vez que el tiempo de esterilización haya terminado se dejara enfriar el medio de cultivo hasta unos 40°C, entonces se podrá vaciar en cajas de Petri, es importante que estas cajas se encuentren selladas, ya que esto garantizara su esterilidad, además se deberán tener mecheros Fisher prendidos sobre la mesa de trabajo, ya que el calor que estos emiten mantienen estéril tanto el medio de cultivo como el resto del material utilizado, ya que los microorganismos son susceptibles a la acción del calor, aunque en distinto grado. (Oca, 2012)

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