“Rol del dominio rico en Q/N de Tpk2 en la localización de la enzima en P-bodies en estrés nutricional y fase estacionaria de Saccharomyces cerevisiae”

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

TRABAJO PRÁCTICO ESPECIAL

“Rol del dominio rico en Q/N de Tpk2 en la localización de la enzima en P-bodies en estrés nutricional y fase estacionaria de Saccharomyces cerevisiae”

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Alumnas: Bárbara Mc Cormack y Clara Solari.

Jefe de trabajos prácticos: Martín Monte

Materia: Biología Molecular

En este trabajo se pretende evaluar si el dominio rico en Q/N de la isoforma Tpk2 de la subunidad catalítica de la PKA de Saccharomyces cerevisiae es necesario para que esta enzima se localice en gránulos de procesamiento de RNA (P-bodies). Para esto se propone clonar Tpk2 con el dominio en cuestión deletado, y hacer una proteína de fusión Tpk2-GFP para determinar su localización durante fase estacionaria y durante el hambreado de glucosa en fase exponencial.

1. Objetivo

El objetivo de este trabajo es obtener plásmidos recombinantes conteniendo: la enzima Tpk2wt, la enzima Tpk2 con los primeros 50 aminoácidos deletados (Tpk2Δ50), Tpk2wt-GFP, o Tpk2Δ50-GFP. Con estos plásmidos se podrán realizar ensayos de localización subcelular por microscopía de fluorescencia para evaluar si el dominio rico en Q/N del extremo N-terminal de Tpk2 determina su localización en P-bodies durante el hambreado de glucosa en fase exponencial y durante fase estacionaria.

1. Introducción

2.1 La proteína quinasa A

La quinasa dependiente de cAMP (PKA) es una proteína capaz de fosforilar diversos sustratos. Está conservada desde levaduras hasta el hombre, aunque difieren entre sí. La secuencia consenso de fosforilación de esta proteína es RRXS, donde el residuo serina (S) es preferido como sitio fosfoaceptor. En ausencia de cAMP la enzima se encuentra formando un heterotetrámero compuesto por dos subunidades catalíticas (C) y dos regulatorias (R). Al aumentar la concentración intracelular de cAMP, las subunidades catalíticas unen cAMP y se disocia del complejo como un homodímero (R/R), liberando las dos subunidades catalíticas como monómeros activos.

La subunidad regulatoria de la PKA de Saccharomyces cerevisiae está codificada por un único gen, BCY1. En cambio la subunidad catalítica posee tres isoformas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3; las cuales son muy similares únicamente en su extremo C-terminal, dado que sus extremos N-terminal difieren tanto en secuencia como en longitud. En S. cerevisiae, la afinidad aparente entre R y C disminuye 20 veces por el agregado de cAMP.

La deleción de los tres genes que codifican para las Tpks resulta letal para la célula, sin embrago la expresión de uno solo de ellos -cualquiera sea- es suficiente para que la célula sea viable. Esto se debe a que a través de la fosforilación de diversos sustratos, la PKA regula procesos que intervienen en el crecimiento celular, la respuesta a los nutrientes y el estrés. Por ende, las mutaciones que afectan los niveles de actividad de la PKA dan lugar a fenotipos pleiotrópicos. Dentro de los fenotipos relacionados a la hiperactividad de la señalización de la vía cAMP-PKA se incluyen: la resistencia a la rapamicina, el crecimiento acelerado de pseudos-hifas, el arresto transitorio del ciclo celular en G1, y el aumento de la sensibilidad al estrés como aumentos de temperatura o la falta de nutrientes. Mientras que algunos de los fenotipos resultantes de la reducción de la actividad de PKA son: hiperacumulación de cAMP, la disminución de los niveles de ARNm de proteínas ribosomales, entre otros.

2.2 Estrés nutricional y fase estacionaria

El estado de un cultivo de levaduras tiene tres etapas: fase exponencial, fase post-diáuxica y fase estacionaria. En esta última se considera que el cultivo está saturado y la mayoría de las células quiescentes. Las características de las células quiescentes difieren de las células en proliferación, entre otras cosas disminuyen la síntesis global de proteínas. La vía cAMP-PKA está implicada en el ciclo celular: la inactivación de PKA es necesaria para la entrada a quiescencia, y su activación es necesaria para la salida de esa fase.

El hambreado de glucosa durante fase exponencial está reportado como un estrés nutricional severo que provoca una inhibición rápida y reversible de la traducción.

2.3 Gránulos citoplasmáticos

Los mRNA se encuentran unidos a proteínas, formando complejos ribonuceoprotéicos (RNPs). La composición de estos complejos determina el procesamiento, degradación o almacenamiento de los mRNA. Se han reportado diversos gránulos citoplasmáticos conformados por RNPs, por ejemplo los Processing bodies (PBs), presentes en levaduras, plantas, nematodos, moscas y mamíferos. Estos gránulos tienen un comportamiento dinámico y se forman en períodos de inactivación traduccional. Los complejos RNPs que los conforman tienen proteínas asociadas a degradación de mRNA e inhibición de la traducción. Si bien la composición protéica de los PBs no está completamente definida, algunas proteínas están presentes en estos gránulos desde levaduras hasta mamíferos. Dentro de este grupo, se encuentran algunas proteínas involucradas en decapping, como Dcp1 y Dcp2, frecuentemente utilizadas como marcadores de P-bodies.

En levaduras, existe una interdependencia en el reclutamiento de RNPs hacia los PBs, siendo el RNA el único componente estrictamente necesario para la formación de los gránulos. Hasta la fecha no está bien definida la regulación de la formación de estos gránulos, sin embargo, se sabe que muchas de las proteínas presentes en PBs poseen dominios tipo prión, que mediante modificaciones post-traduccionales regularían la agregación protéica de los PBs. Dentro de este grupo de dominios, se encuentran las regiones ricas en glutamina y/o asparagina (Q/N). Anteriormente se ha demostrado que estos tractos de aminoácidos son necesarios para la localización de algunas proteínas en los PBs. Tpk2 posee en su región N-terminal un dominio rico en Q/N, pero hasta la fecha no se lo a relacionado con su localización en PBs.

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