Succinato deshidrogenasa

HIPÓTESIS

Si la Succinato deshidrogenasa es una enzima inducible entonces se encontrara una mayor actividad de esta enzima en presencia de Succinato como fuente de Carbono

Si la Succinato deshidrogenasa es una enzima que se reprime en presencia de glucosa, entonces se vera disminuida su producción y por lo tanto actividad total en Escherichia coli.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Si la actividad de la Succinato Deshidrogenasa de Escherichia coli depende de las condiciones de cultivo se montarán dos cultivos de una cepa de Escherichia coli silvestre a diferentes condiciones. Estarán crecidos ambos en medio Sypher y Strauss como medio mineral, uno de ellos tendrá Glucosa al 1.0%(1) y el otro Succinato al 0.5%(2), las diferencias entre estas concentraciones se deben a cuestiones equimolares propias de cada molecula, ya que no se obtendrá la misma cantidad de sustrato al tener una preparación de 1% de glucosa que al hacerlo con la de Succinato, es por eso que se da este ajuste 1:2 en relación Succinato-Glucosa para hacer la diferenciación; se incubarán a 37°C en agitación durante 12 horas. Posteriormente, de estos medios se cosecharán las células por centrifugación, con regulador de fosfatos pH=7.3. A partir de un volumen de 10 mL de las células resuspendidas con regulador de fosfatos (1 y 2) se inocularán dos matraces por cada condición inicial de cultivo, será un matraz conteniendo Succinato al 0.5% y otro conteniendo glucosa al 1%. Así tenemos una serie de matraces a diferentes condiciones de cultivo:

Estos matraces se incubarán a 37°C durante 5 horas. Posterior al tiempo de incubación, se tomará una lectura de éstas células a tiempo inicial a una longitud de onda de 600nm para evaluar el crecimiento de E. coli en las diferentes condiciones. Después de incubar a 37°C durante 5 horas se tomarán las lecturas de absorbancias a 600nm para compararlas con las lecturas iniciales y observar que medio presenta mayor crecimiento.

Para medir la actividad de la Succinato Deshidrogenasa se usará un ensayo colorimétrico basado en la sustitución de algunos aceptores de electrones en la cadena respiratoria por aceptores de electrones artificiales, los cuales son capaces de captar electrones de la cadena respiratoria en reacciones espontaneas no enzimáticas; para dicho efecto se emplean los siguientes compuestos:

2,6 Diclorofenol Indofenol (aceptor artificial)

Cianuro de potasio (Inhibidor de la CTE)

Metosulfato de fenazina (aceptor artificial)

Regulador de fosfatos

Succinato de sodio (sustrato)

La sustitución se basara en el siguiente mecanismo de reacción:

La oxidación del Succinato, catalizada por la Succinato deshidrogenasa, genera electrones que reducen el compuesto Metosulfato de fenazina (PMS) que posteriormente reducirá al 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP). La función del cianuro de potasio (KCN) es bloquear la enzima terminal de la cadena respiratoria asegurando la transferencia de electrones hacia la reducción del DCPIP, mientras que la función de PMS es la de ser un acarreador de electrones, los cuales llegaran al aceptor final de estos que es el DCPIP.

Al ser interrumpida la cadena respiratoria por el KCN, los complejos quedan reducidos hasta perder su color, el 2,6-DCPIP es el primero en tornarse incoloro, quedando la solución de color amarillo debido al Metosulfato de fenazina, que posteriormente, al ser reducido completamente también se tornara incoloro.

Para la determinación se colocarán los reactivos en tubo de ensaye, teniendo en cuenta que el último en ser adicionado será la suspensión celular, posteriormente se agita y se mide el porcentaje de transmitancia a una longitud de onda de 600nm ya que a esta longitud se lee el color verde. El color verde se origina por la combinación del color amarillo del Metosulfato de fenazina y el azul del 2,6 diclorofenol indofenol, al reducirse el 2,6 diclorofenol indofenol se vuelve incoloro, por lo que la intensidad

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