ENZIMAS MITOCONDRIALES. SUCCÍNICO DESHIDROGENASA.

12. ENZIMAS MITOCONDRIALES.  SUCCÍNICO DESHIDROGENASA

MITOCHONDRIAL ENZYMES. SUCCINIC DEHYDROGENASE

Balaguera – Torres, A1*.  Pérez - Ariza,J2*.  Nitola – Orduz.J3*.

Fecha de entrega: 10 de Noviembre de 2015

RESUMEN

En esta práctica se favoreció el conocimiento sobre las enzimas mitocondriales, usando succinato deshidrogenasa, en donde se extrajeron y se prepararon las respectivas enzimas y coenzimas de tres diferentes tipos de tejidos animal (hígado de res, Carne de res y Corazón de pollo), luego se realizó mediante diferentes set de tubos un seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa, en donde se obtuvo una velocidad de decoloración respectiva en cada tejido, teniendo un menor tiempo de decoloración en el tejido de corazón de pollo, seguido del hígado de res y curiosamente el último en decoloración fue la carne de res.

Palabras clave: succínico deshidrogenasa, Extracción de enzimas, coenzima

Abstract

In this practice, knowledge on mitochondrial enzymes, was favored by using succinatedehydrogenase,where were extracted and prepared the respective enzymes and coenzymes of threedifferent types of animal tissues (beef, beef and chicken heart liver), then tracked through different setof tubes of the reaction catalyzed by succinic dehydrogenase where was obtained a speed ofrespective discoloration in each tissue, taking a shorter fade into heart of chicken, followed by beefliver tissue and curiously the latter in discoloration was beef.

Key words: succinic dehydrogenase enzymes extraction, coenzyme

INTRODUCCIÓN

La capacidad de las fibras musculares para oxidar los hidratos de carbono y las grasas es difícil de determinar. Numerosos estudios han demostrado la existencia de una estrecha relación entre la capacidad de un musculo para ejecutar ejercicios aeróbicos prolongados y la actividad de sus enzimas oxidativas. Dado que se necesitan muchas enzimas para la oxidación, la actividad enzimática de nuestras fibras musculares proporciona una indicación razonable de su potencial oxidativo.

Medir la totalidad de las enzimas en los músculos es impracticable, por lo que se han regido unas pocas representantes para reflejar la capacidad aeróbica de las fibras. Las enzimas medidas más frecuentemente son las succionato deshidrogenasa (SDH) la cual se va a a considerar en el presente experimento y la citratosintasa (CS), enzimas mitocondriales que intervienen en el ciclo de Krebs.

La enzima succinato deshidrogenasa (SDH), succinato coenzima Q reductasa o complejo II mitocondrial, es un complejo proteico ligado a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones, y que contiene FAD (flavín-adenín-dinucleótido) unido covalentemente. Es la única enzima que participa en el ciclo de ácido cítrico y la cadena de transporte de electrones.

La enzima succionato deshidrogenasa forma parte de una serie de reacciones químicas que se llevan a cabo dentro del ciclo de Krebs y tiene como función en la reorganización de moléculas a cuatro átomos de carbono hasta la regeneración del oxalacetato. Para que eso sea posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un carbonilo. Como ocurre en otras rutas, por ejemplo en la beta oxidación de los ácidos grasos, tal conversión ocurre mediante tres pasos: una primera oxidación, una hidratación y una segunda oxidación. Estos tres pasos, además de regenerar oxalacetato, permiten la extracción ulterior de energía mediante la formación de FADH2 y NADH. 
La primera reacción de oxidación es catalizada por el complejo enzimático de la succinato deshidrogenasa, la única enzima del ciclo que tiene como aceptor de hidrógeno al FAD en vez de al NAD+. El FAD es enlazado de modo covalente a la enzima por un residuo de histidina. La enzima se vale del FAD ya que la energía asociada a la reacción no es suficiente para reducir el NAD+. 
El complejo enzimático también es el único del ciclo que pasa dentro de la membrana mitocondrial. Tal posición se debe a la implicación de la enzima en la cadena de transporte de los electrones. Los electrones pasados sobre el FAD se introducen directamente en la cadena gracias a la unión estable entre la enzima y el cofactor mismo. Las reacciones restantes del ciclo oxidan al succinato a oxalacetato, éste al regenerarse, permite otra vuelta del ciclo. La succinato deshidrogenasa cataliza la oxidación estereoespecífica del enlace - CH2 –CH2 – del succinato a doble enlace trans, dando el fumarato.

La enzima succinato deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de Krebs que no se encuentra en la matriz mitocondrial, sino que en la membrana mitocondrial interna, con el sitio de unión del sustrato accesible desde la matriz. Es además la única en el ciclo asociada a un grupo prostético flavínico (FAD) mediante el cual los equivalentes de reducción del succinato son transferidos a la ubiquinona, componente de la cadena de transporte de electrones. En general la función bioquímica del FAD es oxidar alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida alcoholes a aldehídos o cetonas. El malonato es un fuerte inhibidor.

La práctica es enfocada en la observación del 2,6-diclorofenolindofenol y el azul de metileno resultan ser indicadores redox apropiados para funcionar en los homogenizados de tejidos.

Se trata de sustancias de color azul en su forma oxidada, que al aparecer átomos de hidrógenos del sustrato originan la forma leuco, la cual es incolora. Con este cambio del indicador redox se comprueba que la enzima está transformando el sustrato.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

• Extracción y preparación de las enzimas

Se Realiza el siguiente procedimiento para obtener el extracto enzimático.[pic 1]

Maceración de 5 gramos del tejido libre (hígado de res, carne de res (musculo), corazón de pollo); la maceración es realizada en combinación con arena y 5 porciones de 5ml  buffer fosfato.  Se realiza centrifugación a la muestra con el fin de separar la enzima del remanente innecesario. Es mantenido en un baño de hielo con el fin de no permitir su activación a un momento inadecuado.

• Seguimiento de la reacción catalizada por la succínica deshidrogenasa.

El montaje de las pruebas es reflejado en la tabla 1 (Anexada); los resultados en la tabla 2 (Anexada).

Para el posterior análisis es necesario tener en cuenta la función de cada sustancia en las preparaciones realizadas.

Azul de metileno: Tiene como función ser el aceptor e electrones de complejo succinato-FADH2. Es utilizado para hacer una detección cuantitativa del estado de oxidación-reducción. Aceptor electrónico artificial coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se re oxida la coenzima FAD.

Aceite mineral: Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire se re oxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrogeno, por esta razón el sistema se aísla mediante la capa de aceite mineral formada previniendo la oxidación temprana del FADH2.

Succinato de sodio 1%: Tiene la función de reducir al azul de metileno, ya que éste es reducido en lugar del succinato.

Malonato: inhibidor competitivo

[pic 2]

Hígado de res

 Debido a la preparación de los tubos es esperado obtener la decoloración en el siguiente orden:

3-2-1 en este orden debido a que se reduce la cantidad de enzima en cada tubo respectivamente lo que indica que a menor cantidad de enzima va a generarse una velocidad catalítica menor; orden de oxidación es observado en el color.

4 que la presencia del malonato inhibe la actividad catalítica de la enzima.

B no debería existir cambio debido a que no hay presencia de succinato de sodio luego no existe reducción del azul de metileno, no hay transporte de electrones.

Los resultados obtenidos, reflejados en la tabla 2 (anexada) mostraron que el orden en la decoloración de las soluciones se dio de la siguiente manera:

3 – 2 – B – 4 – 1

El comportamiento mostrado no resulta como el esperado posiblemente a la preparación inapropiada de las soluciones o del set de tubos y en un caso extremo la rotulación equivocada. No existe explicación diferente al hecho de no haber obtenido el comportamiento según las adiciones en los tubos teniendo en cuenta la función de cada reactivo en el set de tubos enunciado anteriormente.

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