TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRÍA

TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRÍA
nota: 8 (ocho)

ALUMNOS:

• Benzoni, Carla
• Graff, M. Victoria
• Izzo, Guadalupe
• Zapata, Sebastián
  

COMISIÓN: 2

JTP: Federico Monczor

AYUDANTES: Laura Fischerman; Florencia Scochera

AÑO: 2015 – 2º Cuatrimestre

OBJETIVOS:

 Primera Parte:

• Controlar y asegurar el buen funcionamiento de un espectrofotómetro.

Segunda parte:

• Calcular la concentración de proteínas de una solución empleando la reacción del Biuret como técnica espectrofotométrica.
• Cálculo de Absortividad de una muestra de Rojo Congo

FUNDAMENTOS:

La espectrofotometría nos permite, mediante la espectroscopia atómica y molecular, obtener información a partir del análisis de las distintas interacciones de las radiaciones electromagnéticas con la materia.
Una manera de conocer la concentración de una solución consiste en medir el efecto que dicha concentración tiene sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide sobre ella.
Si se ilumina la solución con luz monocromática (luz de una sola longitud de onda) ocurrirá que parte de la intensidad de esa luz (Io) será absorbida por las moléculas que están en dicha solución (Ia), parte se refleja (Ir) y parte será transmitida (It) (si la incidencia del haz de luz es normal a la pared del tubo que contiene la solución, la luz reflejada será despreciable); para que se cumpla el principio de conservación de la energía:    Io = Ia + It, dividiendo todos los términos por Io, se obtiene la expresión: 1 = S + T; siendo S absorción y T  transmitancia.

La variación de la intensidad transmitida con respecto a la incidente es directamente proporcional al espesor del material interpuesto (l) y a una constante (k) propia de cada material, llamada coeficiente de absorción; de esto deriva la ley de Lambert, que dice que la intensidad de la luz monocromática transmitida decrece cuando el espesor del medio absorbente crece, y, por un desarrollo matemático análogo se obtuvo también la Ley de Lambert - Beer  It = Io. (donde a es una constante denominada absortividad; es propia de cada sustancia y depende de la longitud de onda, la temperatura y el solvente con que se trabaje) que dice que la intensidad de luz monocromática transmitida por la solución de una sustancia determinada decrece cuando su concentración aumenta (esta ley se cumple trabajando a bajas concentraciones y en presencia de luz monocromática). La ley de Lambert - Beer también permite establecer una relación entre transmitancia (T) y concentración aunque no existe una relación lineal entre ellas (la transmitancia decae en forma exponencial con la concentración); la absorbancia (Abs) que es  – logaritmo T es un nuevo parámetro y si se representa gráficamente Abs en función de la concentración, el gráfico mostrará una relación lineal entre las dos variables siempre que la sustancia utilizada cumpla con la ley de Lambert - Beer.
A partir de la ley de Lambert-Beer se pueden estudiar sustancias coloreadas en el visible aportando mucha información acerca de ellas; como instrumento de medición se utiliza un espectrofotómetro que determina transmitancia a partir de la medida de intensidad transmitida comparándola con la intensidad incidente; el espectrofotómetro posee dos tipos de tipos de escalas: la escala de transmitancia %, que es lineal y abarca de 0 a 100% y la escala de absorbancia que es logarítmica y abarca de 0 a .
Para informar un resultado confiable es necesario estar seguros de que el equipo utilizado funcione correctamente, por ello se realizan los controles espectrofotométricos que permiten controlar y analizar determinados parámetros y verificar si se encuentran dentro de los rangos de aceptabilidad establecidos.

Control de luz espuria: la luz espuria es toda la luz que llega al detector sin haber atravesado la muestra; puede presentarse una luz espuria accidental generado por errores del operador, por ejemplo si se cierra de manera errónea la tapa del espectrofotómetro e incide la luz espuria en el tubo con la muestra. Estos accidentes son detectados mediante filtros o soluciones opacas como una solución muy concentrada de colorante (contra una cubeta con agua, a  seleccionada dentro del visible). La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y el máximo aceptado es 1%. Además de la luz espuria accidental existe la luz espuria parásita, que es la radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada que llega al detector, pasando o no por la muestra.

Control de volumen mínimo: Se considera volumen mínimo, al mínimo volumen contenido en una cubeta a partir del cual la lectura se estabiliza y no varía con el agregado de más líquido. Dicho control nos asegura que toda la luz pase por la solución y no pase por otro lado, lo que produciría resultados erróneos. Este control es importante también desde el punto de vista económico, para ahorrar en el uso de los reactivos.
Control de cubetas: Se realiza para determinar las cualidades ópticas y de construcción de las cubetas de medida. Se mide la T % de las cubetas con un volumen determinado de agua, tomando una como referencia y luego se verifica la desviación que tiene las demás cubetas con respecto a esta; la desviación debe ser menor al 1% de T.
Control de centro de banda: Dicho control se realiza para verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada y la real (la que le llega a la muestra). Para realizar dicho control se realiza  un barrido espectral que consiste en medir la absorbancia de una sustancia  de referencia en diferentes longitudes de onda (el gráfico de Abs en función de longitud de onda constituye el espectro de absorción de la sustancia y es característico de cada una), la referencia tiene que presentar diferentes picos de absorción que deben ser estrechos y bien definidos, por lo tanto se tienen que conocer las longitudes de onda máxima. Si al realizar el barrido espectral la medición del valor de la longitud de onda correspondiente a la máxima absorción leída coincide con el valor de la referencia podremos asegurar que en esa zona el aparato trabaja a las longitudes de onda indicadas por el selector pudiendo trabajar con confianza en ese intervalo, en cambio si esto no sucede hay un corrimiento de la longitud de onda (en nm) y por lo tanto se tendrá que corregir dicho corrimiento para poder utilizar adecuadamente el equipo.

Control de linealidad fotométrica: Indica la linealidad de respuesta del sistema de detección, y por ende el rango de utilidad de medida de instrumento. Para este control se debe trabajar con algún colorante en solución, que se sabe que cumple con la Ley de Lambert-Beer (presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentración en el rango de trabajo utilizado) se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones crecientes del colorante utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de referencia certificadas. Si el equipo cumple con el control el gráfico de absorbancia experimental en función de absorbancia de referencia será lineal hasta el último valor de absorbancia experimental y éste último valor será el máximo valor de absorbancia aceptable para cualquier otra medida. Cuando no se dispone de los valores de referencia de absorbancias y sí se conocen las concentraciones de las soluciones a medir, se puede realizar un gráfico de absorbancia en función de concentración a partir del cual también se podrá evaluar la linealidad fotométrica.

Control de veracidad fotométrica: A través de éste control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia, obtenida con una solución estándar de referencia medida en un equipo calibrado, y la absorbancia de la misma solución medida en el equipo que se está controlando. El control permite analizar la veracidad de los resultados obtenidos con el equipo controlado.

Control de la precisión fotométrica: Este control tiene como finalidad evaluar la repetibilidad de una serie de medidas de absorbancia obtenidas al realizar varias medidas de una misma solución. A mayor repetibilidad en la serie de datos, habrá mayor precisión o bien menor dispersión. Se utiliza una solución coloreada cuyo requisito básico es que su valor de absorbancia sea estable a través del tiempo.

Si disponemos de una sustancia conocida y queremos trabajar con ella para realizar una cuantificación debemos elegir la longitud de onda óptima de trabajo, la cual se selecciona teniendo en cuenta el espectro de absorción de la sustancia. Se prefiere un máximo de absorbancia, dado que así se obtiene mayor sensibilidad en las lecturas y hay que evitar trabajar en regiones del espectro donde hay cambios bruscos de absorbancia, ya que un pequeño desplazamiento en la longitud de onda puede causar un error grande en la correspondiente lectura.
En el trabajo práctico se realizó una reacción colorimétrica para determinar la concentración de proteínas totales presentes en una muestra (o solución incógnita), midiendo su absorbancia y la de soluciones testigo (que contienen al analito en una concentración conocida).
Cuando el analito no es coloreado se usa una reacción química, donde el color generado se debe a la reacción del analito con el reactivo (tal es el caso para proteínas con la reacción del Biuret); el reactivo debe estar en exceso para poder reaccionar con todo el analito presente en la muestra.
La presencia de un solvente o sustancias presentes en la muestra que no sean específicamente el analito pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la absorbancia leída de dicho tubo; para esto se deben preparar otros tubos que los contengan para descontar dicha/s absorbancia/s ya que no corresponde/n al analito que se quiere medir.
Tubo de referencia o blanco de solvente: puede contener agua o el solvente que se utilice en la reacción y que estará presente en todos los tubos; contra este tubo se leerán todos los demás, es decir con él se llevará a cero de absorbancia y será la referencia.
Tubo blanco de reactivo: contiene todos los reactivos necesarios para que se realice la reacción, pero no contiene a la muestra o al testigo; por lo tanto la medida de absorbancia de éste será descontada a la del tubo de muestra y a la del tubo de testigo para obtener por diferencia el valor de la absorbancia debida solamente a la muestra o al testigo, según corresponda.
Tubo blanco de muestra: este tubo contiene a la muestra pero no al reactivo; se utiliza para medir la contribución de otros analitos o sustancias interferentes que estén presentes en la muestra y que no son el analito, la medida de absorbancia de este tubo también será descontada del tubo de muestra.

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