CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

PREINFORME N° 02

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

OBJETIVOS:

OBJETIVOS GENERALES

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA) con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Diseño del medio de cultivo.

Activación celular y desarrollo del inóculo.

Identificar y describir las partes, accesorios y geometría, conocimiento de la operación del fermentador, esterilización, carga, descarga y toma de muestras.

Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automatico, asi como la calibración de los sensores.

Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar µmax y Yx/s

Obtener los perfiles de masa celular, fuente de C y O2 disuelto a través del tiempo total de fermentación en el bioreactor.

Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

Determinar Yx/s y Qx del CLA.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:

Empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo.

El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

ESQUEMA

Donde F(t): caudal de alimentación

Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación

Vf: volumen final de trabajo

Vo: volumen al inicio de la alimentación

Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación

So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So son las condiciones finales de dicho batch.

Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple, es decir F=cte y Sr=cte.

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

Para diseñar el medio de cultivo se realizará de acuerdo a los alcances que nos proporciona la guía de práctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del microorganismo, para su mantención, activación y para la fermentación del cultivo por lote alimentado.

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas.

Para el diseño se debe considerar:

Usar Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11).

Duración aproximada de 4 a 6 horas de la etapa de CLA.

Usar el bioreactor automatizado Biostat – A Plus recipiente de 2 litros.

Control de pH usando electrodo y unidad de control.

La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

“COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 “

MEDIO SÓLIDO DE MANTENCIÓN (YM sólido)

TABLA 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (80 mL)

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Para 80 mL

Extracto de Levadura 3 0.24

Peptona 5 0.4

Extracto de Malta 3 0.24

Agar 20 1.6

Glucosa 10 0.8

MEDIO DE ACTIVACIÓN

TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (100 mL)

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Para 100 mL

Sacarosa 15 1.5

Extracto de levadura 3 0.3

Extracto de malta 5 0.5

Solución de sales 5 ml/L 0.500

T 35°C, N 200 rpm

MEDIO DE FERMENTACIÓN

TABLA 03, 04 y 05: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación

TABLA 03

Nutriente Concentración (g/l)

Sacarosa

Extracto de Levadura 1.8

(NH4)2SO4

KH2PO4

MgSO4 7H2O

Solución de sales 10ml/L

pH 4.2

TABLA 04 - Concentración de Nutrientes para el medio de Fermentación

Elemento Nutriente % en Célula % en nutriente Y x/s (g/g) S0 (g/l) S’0 (g/l)

C Sacarosa (C12H22O11) 45 42,105 0,5614 3,2062 3,2062

N Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 9 21,21 2,3567 0.7638 1.1457

Mg Sulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0,4 9,86 24,65 0.0730 0.1095

S Sulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0,25 12.99 51.96 0.0346 0.0519

K Fosfato Potásico (KH2PO4) 0,5 28.67 57.34 0.0314 0.0470

P Fosfato Potásico (KH2PO4) 2,0 22.79 11.395 0.1579 0.2369

Limitante: Fuente Carbono

TABLA 05 – Para el medio de Fermentación por Lote 1000 mL

Nutriente Fuente Concentración (g/l) Peso (g)

Para 1000 mL

C12H22O11 C 3,2062 3,2062 g

Extracto de Levadura - 1.8 1.8 g

(NH4)2SO4 N y S 1.1457 1.1457 g

KH2PO4 K y P 0.2369 0.2369 g

MgSO4.7H2O Mg y S 0.1095 0.1095 g

Soluciones de Sales Concentradas 10 ml/L 10 ml/L

Asumiendo que el volumen final será 2 Litros, y que el volumen

F=(V_f-V_0)/t= (2l-1l)/(6 horas)=0.166l/h=2.766ml/min

SOLUCIÓN DE SALES:

Tabla 06 Composición de la solución de sales 100 veces concentrado, utilizadas en los medios de cultivo en g/l

Nutriente Concentración (g/l)

CaCl2.2H2O 1.12

ZnSO4.7H2O 0.11

FeSO4.7H2O 0.06

CuSO4.5H2O 0.05

CoCl2.6H2O 0.01

MoO3 0.0005

MnCl2.6H2O 0.027

NaCl 0.28

PREPARACIÓN DE MEDIOS

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.

Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

Condiciones de Asepsia

Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo.

Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del alumno o grupo.

Encender el mechero Bunsen.

Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapón de algodón, sácalo un poco de manera que no esté muy apretado.

Flamear en el mechero Bunsen, el cual da un área de desinfección de 30 cm a la redonda.

Retirar una tapa con el meñique, mientras sostienes los matraces. Nunca poner las tapas sobre la mesa.

Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones.

Los matraces abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de contaminación sea mínimo.

Sembrar en el matraz estéril el inoculo.

De nuevo flamea las bocas de los matraces y tápalos de nuevo. Asegúrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado.

Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN, según la TABLA 01 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.

Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.

Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza analítica.

Medir 80 ml de agua destilada, en una probeta

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