Caracterización del aceite y composición de la clase de lípidos de las semillas de granada

Caracterización del aceite y composición de la clase de lípidos de las semillas de granada

1. Introducción

Varios estudios han informado de que los aceites consumidos tienen enormes efectos en la fisiología humana, incluido el metabolismo de los lípidos, el desarrollo de enfermedades crónicas y el bienestar [1]. No se ha encontrado ningún aceite de una sola fuente que sea adecuado para todos los fines, ya que los aceites de distintas fuentes suelen diferir en su composición [2]. Por ello, recientemente ha crecido el interés por nuevas fuentes de aceites comestibles. En este sentido, se sabe que las semillas de plantas son una buena fuente de aceites de importancia nutricional, industrial y farmacéutica. Aunque los aceites comestibles convencionales, como el de soja, maíz y canola, tienen su propia importancia, hay otros aceites más raros y desconocidos que tienen características únicas y rasgos que promueven la salud. El aceite de semillas de granada (PSO) es uno de ellos. Se considera un potente agente beneficioso para la salud debido a sus propiedades antioxidantes, anticancerígenas y antilipidémicas [3-5]. Se ha informado de la composición de los ácidos grasos del PSO [1, 6-9], pero se sabe poco sobre la constitución del aceite, especialmente de sus compuestos menores, como los fenoles y los lípidos polares. Además, las grasas y aceites naturales contienen, aparte de glicéridos, una serie de materiales lipofílicos. Entre los más interesantes están los glicolípidos, los fosfolípidos, los esteroles, las vitaminas liposolubles y los fenoles. Sin embargo, el estudio de la PSO por sus constituyentes menores puede ser útil para utilizar tanto el aceite como los constituyentes menores e ectivamente. Por ejemplo, se ha informado de que los compuestos fenólicos están presentes en todos los aceites vegetales como metabolitos secundarios y son importantes para la estabilidad oxidativa de los PUFA de estos aceites [10]. Además, los antioxidantes comerciales, como el butilhidroxianisol (BHA), el butilhidroxitolueno (BHT) y la tert-butilhidroquinona (TBHQ) [11], se añaden habitualmente a los alimentos en muchos fabricantes para evitar el deterioro de la calidad y mantener el valor nutricional de los distintos productos alimentarios, incluidos los aceites y los productos que contienen aceite [12]. En este trabajo se han analizado las propiedades fisicoquímicas, el contenido fenólico, el contenido de pigmentos, la composición de esteroles y la proporción de ácidos grasos de PSO y sus clases de lípidos.

Los resultados serán importantes como indicación de la potencial utilidad económica de la PSO como nueva fuente de aceites comestibles. Además, hasta donde sabemos, no se ha realizado anteriormente ningún estudio sobre el contenido fenólico y las clases de lípidos de la PSO.

1. Materiales y métodos

2.1. Material vegetal. Las muestras de frutos se recogieron en plena madurez de los árboles de granada de la variedad Tounsi en la provincia de Mahdia, Túnez, en octubre de 2015. Los granos se separaron manualmente de la pulpa, se lavaron cuidadosamente y se secaron al sol hasta alcanzar un peso constante.

2.2. Extracción del aceite. El aceite se extrajo por el método de Soxhlet tal y como lo describieron previamente Nasri y Triki (2004) [13]. Se extrajeron unos 30 g de semillas con 200 ml de hexano a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se eliminó por evaporación a 40∘C y el aceite se lavó con una corriente de nitrógeno y se almacenó a -20∘C en tubos sellados.

2.3. Determinación de los índices de calidad. La acidez libre, el índice de peróxido y los índices 𝐾270 y 𝐾232 se determinaron siguiendo los métodos analíticos descritos por el Reglamento CEE/2568/91 de la Comisión de la Unión Europea [14].

2.3.1. Acidez libre. La acidez libre se determinó por titulación de una solución de aceite disuelta en etanol/éter (1 : 1, vol/vol) con una solución etanólica de hidróxido de potasio (0,1 M).

2.3.2. Valor de peróxido. El valor de peróxido se determinó incubando una mezcla de aceite y cloroformo/ácido acético (10 : 15, vol/vol) con una solución de yoduro de potasio en la oscuridad durante 5min. en, se añadieron 25ml de agua y 500𝜇l de Amidon 1% y el yodo liberado se valoró con tiosulfato de sodio Na2S2O3 (0,01 N). El resultado se expresó en miliequivalentes de oxígeno activo por kilo de aceite (meqO2 /kg),

2.3.3. Coeficientes de extinción. Los coeficientes de extinción 𝐾270 y 𝐾232 se calcularon midiendo la absorbancia a 270 y 232 nm, respectivamente, utilizando una solución de aceite al 1% en ciclohexano y una longitud de recorrido de 1 cm.

2.4. Contenido de pigmentos

2.4.1.Contenido de clorofila. El contenido total de clorofila se calculó según el método de Kiritsakis (1998) [15]. La absorbencia se midió a 630, 670 y 710 nm y se utilizó tetracloruro de carbono como blanco. El cálculo del contenido total de clorofila es el siguiente:

donde 𝐴 es la absorbencia del aceite a la respectiva longitud de onda y 𝐿 es el espesor de la célula (cm).

2.4.2. Contenido de betacaroteno. El betacaroteno se midió según el método descrito por Dhibi et al. (2014) [16] y el contenido se expresó mediante la siguiente ecuación: donde 𝐴max es el máximo de absorción entre 440 y 480 nm.

2.5. Determinación de los compuestos fenólicos

2.5.1. Extracción de la fracción fenólica. La fracción fenólica se extrajo siguiendo el procedimiento de Mraicha et al. (2010) [17] con algunas modificaciones. Se mezclaron 4g de aceite con 2ml de hexano y 4ml de metanol/agua (60:40, v/v). La mezcla se agitó vigorosamente y se centrifugó durante 3min a 1490×g. La fracción fenólica se recuperó en la fase hidroalcohólica y la fase hexánica se reextrajo dos veces con 4ml de solución metanol/agua (60:40, v/v) cada vez. Finalmente, las fracciones hidroalcohólicas obtenidas se combinaron, se lavaron con 4ml de n-hexano y se almacenaron a -20∘ C.

2.5.2. Determinación colorimétrica de fenoles totales y O-difenoles. Los fenoles totales y los O-difenoles se midieron siguiendo el método de Montedoro et al. (1992) [18] con pequeñas modificaciones. Para los fenoles totales, se mezclaron 0,4 ml de las fracciones combinadas con 10 ml de reactivo Folin-Ciocalteu (1/10). Tras 1 minuto de incubación, se añadieron 8 ml de solución de carbonato sódico (75 g/l) y la mezcla se incubó durante 2 h en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 725 nm y el contenido se expresó en miligramos de equivalentes de ácido gálico por kg de aceite.

Para el contenido de O-difenoles, se mezclaron 100𝜇l de fracciones combinadas con 1 ml de solución de HCL (0,5 N), 1 ml de solución de una mezcla de NaNO2 (10 g) y MaMoO4⋅2H2O (10 g) en 100 ml de H2O y nalmente 1 ml de solución de NaOH (1 N). Tras 30 minutos de incubación, se midió el contenido de O-difenoles a 500 nm y se expresó en miligramos de equivalentes de ácido gálico por kg de aceite.

2.5.3. Determinación del contenido de flavonoides. El contenido total de avonoides se determinó utilizando el método de Bouaziz et al. (2010) [19]. Se mezcló un ml de extracto o de soluciones estándar de catequina con 4 ml de agua de destilación y se añadieron 0,3 ml de NaNO2 (5%, p/v). A los 5 minutos se añadieron 0,3 ml de AlCl3 (10% p/v) y 2 ml de solución de NaOH (1 M) a los 6 minutos. Por último, se añadieron 2,4 ml de agua destilada para ajustar el volumen nal a 10 ml. Tras una agitación enérgica, se leyó la absorbancia a 510 nm. El contenido de avonoides se expresó como mg de equivalentes de catequina (CEQ)/g de muestra.

2.6. La capacidad de la PSO para eliminar el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) se midió según el método descrito por Bouaziz et al. (2005) [20]. Se mezclaron 0,25 ml de fracción fenólica de PSO con 0,5 ml de solución metanólica que contenía radicales DPPH (6 × 10-6 M). La mezcla se agitó enérgicamente y se incubó durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 517 nm. El efecto de barrido del DPPH se calculó como el porcentaje de decoloración del DPPH mediante la siguiente ecuación:

donde 𝐴𝐸 es la absorbancia de la solución cuando se añade el extracto de la muestra a un nivel determinado, y 𝐴 es la absorbancia de la solución de DPPH. La concentración de extracto que proporciona una inhibición del 50% (IC50) se calculó a partir del gráfico del porcentaje de efecto de barrido frente a la concentración de extracto en la solución.

2.7. La fracción insaponible se extrajo de la PSO con éter dietílico, se secó y se disolvió en cloroformo tal y como describen Lukic et al. (2013) [21]. La identificación y cuantificación de los esteroles se llevó a cabo mediante cromatografía de gases capilar en un Varian 3350 GC (Varian Inc., Harbour City, USA) equipado con una columna capilar VF-5 ms (30m × 0,25mm × 0,25𝜇m) y FID. Las temperaturas del inyector, del horno y del detector fueron de 280, 260 y 290∘C, respectivamente, durante 40 min. Se inyectó un 𝜇l en modo split (1 : 50). Se utilizó helio como gas portador con una tasa de ow de 1,27 ml/min.  Los esteroles (colesterol, bras- sicasterol, 24-metileno-colesterol, campesterol, campes- tanol, estigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-estigmastadienol, clerosterol, 𝛽-sitosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, y Δ5,24-estigmastadienol) se identificaron en el aceite en función de sus tiempos de retención relativos con respecto al patrón interno, el colestanol, según el método de referencia normalizado (CEE, 1991, anexos V y VI). Las cantidades relativas se expresaron como proporciones (%) del total de esteroles.

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