TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

INTRODUCCION

En los últimos años han sido publicados diversos estudios focalizados a la optimización de la producción y escalado de proteínas recombinantes (proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería genética producidas en células distintas a las que se producen en la naturaleza) para uso médico, veterinario e industrial. Aunque se han producido en células de mamíferos, insectos y levaduras, la bacteria Escherichia coli continúa siendo el microorganismo más empleado para la expresión de genes heterólogos o recombinantes.

Muchas proteínas heterólogas expresadas intracelularmente en E. coli se producen rutinariamente con niveles superiores al 15% del total de proteínas celulares producidas en esta bacteria, a menudo en forma de agregados insolubles intracelulares, llamados cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión están determinados por una combinación de factores relativos a la velocidad de plegamiento y agregación, solubilidad de la proteína, estabilidad termodinámica y plegamiento intermediario así como susceptibilidad a degradación proteolítica e interacción con chaperonas .

Al elegir un sistema de expresión de proteínas recombinantes para incrementar los niveles de producción de las mismas deben tenerse en cuenta muchos factores. Estos incluyen características del crecimiento celular, niveles de expresión, expresión intracelular y extracelular, modificaciones post-traduccionales, actividad biológica de la proteína de interés, así como características especiales en el caso de la producción de proteínas terapéuticas. La selección de un sistema particular de expresión requiere además la valoración de costos del proceso así como de otras consideraciones económicas. Si bien E. coli es el microorganismo más empleado para la producción de proteínas recombinantes, debido en parte al conocimiento de la biología molecular del mismo, no todos los genes pueden expresarse eficientemente en este microorganismo.

Esto puede estar determinado por las características de la secuencia génica, estabilidad y eficiencia traduccional del ARN mensajero (ARNm; molécula usada como molde, formada a partir de la secuencia de ADN necesaria para la síntesis de una determinada proteína), plegamiento proteico, degradación proteica por enzimas celulares llamadas proteasas, diferencias de uso de determinados codones (código de ADN que indica un determinado aminoácido), así como la toxicidad potencial de la proteína heteróloga en la célula donde se va a producir. Las mayores desventajas de los sistemas de expresión en E.coli incluyen la incapacidad de realizar modificaciones post-traduccionales (o sea modificaciones que se realizan en las proteínas inmediatamente después que la misma ha sido sintetizada en la célula) en proteínas eucariotas (proteínas sintetizadas en células no bacterianas), la carencia de mecanismos de secreción para la liberación eficiente de proteínas al medio de cultivo, y limitada capacidad de formación de puentes disulfuro. Sin embargo, por otro lado, muchas proteínas eucariotas retienen su actividad biológica en forma no glicosilada pudiendo ser producidas eficientemente en E.coli.

Para la expresión de proteínas heterólogas se utilizan vectores como el pET, en estos sistemas, los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del bacteriófago T7, la expresión de la proteína es inducida cuando la célula hospedera provee una cantidad de RNA polimerasa T7; en unas pocas horas el producto formado puede ser más del 50% de la proteína total de la célula. Sin embargo, para que se exprese la RNA polimerasa T7 y se lleve a cabo la expresión de la proteína de interés, se tiene que añadir lactosa o un análogo de ésta, como el isopropil β-D tiogalactosido (IPTG), el cual no es hidrolizable de la lactosa y que sirve como inductor artificial del operon lactosa.

Imagen 1. Expresión de proteínas recombinantes. Generalidades

Imagen 2. pET15b+His+OmpA-alpha vector

OBJETIVOS.

• Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli.

• Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa)

• Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante.

• Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante.

• Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes.

HIPÓTESIS.

Si el gen para la producción de una proteína se integró, su expresión podrá ser inducida, con un análogo de la lactosa, ya que se encuentra bajo el control de las regiones reguladoras del operón de la lactosa.

RESULTADOS.

ANALISIS DE RESULTADOS.

CONCLUSIONES.

CUESTIONARIO.

1. ¿Qué es una proteína recombinante?

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas heterólogas, es decir, de diferente origen. Generalmente se aplica este nombre a moléculas producidas por la unión artificial y deliberada, in vitro, de ADN proveniente

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