ANALISIS ELECTROFORETICO

ANALISIS ELECTROFORETICO DEL DNA

I. INTRODUCCION:

La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar moléculas cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo positivo. Uno de los factores que afecta la separación de las moléculas en una electroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los grupos fosfato le dan la carga a la molécula. Los grupos fosfato son grupos ácidos con pK bajos, esto significa que a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan cargados negativamente. Por lo anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son moléculas cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético se desplazarán hacia el polo positivo.

Un mecanismo para separar moléculas por electroforesis se basa en que tengan diferente carga, ello hace que se desplacen hacia uno u otro polo y que lo hagan a diferente velocidad, es decir, separación de moléculas por diferencia en su movilidad electroforética. Para el caso del DNA, se considera que, independiente de su tamaño, todos tienen la misma movilidad electroforética. Para separar moléculas de DNA de diferente tamaño se incluye en el sistema la utilización de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida (acrilamida más bis-acrilamida).

El gel consiste en un soporte sólido, poroso, a través del cual el DNA tiene que desplazarse durante la electroforesis. Las moléculas de menor tamaño se desplazarán a una mayor velocidad que las moléculas de mayor tamaño. Todas las de un determinado tamaño se desplazarán la misma distancia en un tiempo dado.

Cuando se utilizan geles de poliacrilamida la resolución de las electroforesis de DNA es mayor, es decir, permite discriminar entre DNAs con diferencias mínimas de tamaño, en el caso de las electroforesis de secuenciación, permite diferenciar un DNA de 100 bases de otro de 101 bases.

Por su naturaleza y por las cantidades pequeñas que manejamos en el laboratorio, el DNA no es visible al ojo humano. Para visualizar el DNA utilizamos técnicas de coloración. La más usada por su sensibilidad, sencillez y rapidez es la visualización con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es una sustancia que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA y al excitarlo con luz ultravioleta emite luz visible, es decir, es una sustancia fluorescente. El bromuro de etidio es mutagénico y para su visualización se requiere de una lámpara de luz ultravioleta, por esas razones su aplicación con fines académicos ha sido limitada. Recientemente contamos con un colorante seguro para visualizar DNA, Bio-Safe DNA, aunque de menor sensibilidad, evita los inconvenientes del bromuro de etidio, no es mutagénico y para la visualización no se requiere lámpara de luz ultravioleta. La sensibilidad del bromuro de etidio es de 1 ng, mientras para Bio-safe de 10 ng.

Una vez separados los ácidos nucleicos, estos pueden ser transferidos a membranas (papel) de celulosa o nylon por capilaridad.

La electroforesis se hace con varias finalidades: evaluar el resultado de un proceso de extracción de DNA, comparando un DNA de concentración y tamaño conocidos se puede estimar el tamaño y cantidad de otro, evaluar el resultado de una amplificación realizada por PCR, separar DNA de diferente tamaño (producidos al cortar con enzimas de restricción), separar DNA para transferirlo a membranas con el fin de hacer hibridación con sondas, etc.

La extracción de DNA, corte con enzimas de restricción, separación por electroforesis, transferencia a membranas y la hibridización con sondas; son procedimientos que se realizan con fines diagnósticos, identificación de personas en medicina forense y en estudios de paternidad, entre otros

II. OBJETIVOS:

• Realizar la corrida electroforética del DNA genómico

• Determinar el peso molecular de las muestras de DNA por comparación con un marcador de peso molecular.

III. MATERIAL Y METODOS:

3.1. Materiales:

a) Laboratorio:

• Micropipetas

• Tips

• Tubos Eppendorf

• Cámara de electroforesis horixontal

b) Reactivos:

• Agarosa

• Bromuro de etidio m10mg/ml

• Marcador de perso molecular para DNA

Buffer TAE 1X

• Tris-HCl

• Ácido Acético

• EDTA

Loading buffer (Buffer de carga de la muestra)

• Tris-HCl

• Glicerol 50%

• Azul de bromofenol

• Azul de xilencianol

• EDTA

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA

1. Utilizar un vaso o erlenmeyer de 100 ml para preparar la solución del gel

2. Añadir 32 ml de Tampón de electroforesis tae más 0.30 gr de agarosa, agitar la mezcla para disolver los grumos de agarosa.

3. Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el método más rápido es la utilización de un microondas, también puede utilizarse un placa calefactora, en ambos casos, para que la agarosa se disuelva se ha de llevar la solución a ebullición. La solución final debe aparecer clara sin partículas aparentes.

4. Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC (para acelerar el proceso se puede enfriar colocando el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se produce mucha evaporación del líquido, añadir tampón de electroforesis.

5. .Añadir la solución de agarosa al molde. Agregue 5 mL de TAE o TBE 1X sobre el gel en los sitios donde esta insertada la peinilla 7. Retire cuidadosamente la peinilla Agregue buffer a la cámara, TAE o TBE 1 X, hasta cubrir completamente el gel

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