Análisis serológico y Inmunoblotting

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Identificación de Espiroquetas Relacionadas a Treponema pallidum en Gingivitis Necrótica Ulcerativa y Periodontitis Crónica.

George R. Riviere, D.D.S., Ph.D., Murriel A. Wagoner, B.S., Sharon A. Baker-Zander, M.S., Kathryn S. Weisz, B.S., Donald F. Adams, D.D.S., M.S., Lloyd Simonson, Ph.D., and Sheila A. Lukehart, Ph.D.

N England Journal of Medicine 1991; 325:539-543August 22, 1991DOI: 10.1056/NEJM199108223250803

Las espiroquetas son algunas de las bacterias más comunes que se encuentran en la placa subgingival asociada con las enfermedades periodontales, pero muchas especies que se han observado directamente no se han aislado, cultivado, o caracterizado. 1 Los pacientes con gingivitis ulcerativa necrotizante aguda 2 o adulto Periodontitis Crónica 3 4 5 tienen los niveles más altos de anticuerpos en suero para treponemas cultivables de la placa dental que hacen las personas con los tejidos periodontales sanos, y es posible que las espiroquetas no cultivables también estimulan anticuerpos en pacientes con estas enfermedades periodontales.

Tal vez el grupo más conocido de espiroquetas cultivables son los patógenos asociados con las treponematosis: Treponema pallidum subespecie pallidum (sífilis venérea), T. pallidum subespeciepertenue (pian), T. pallidum subespecie endemicum (sífilis endémica), y T. carateum (pinta). La subespecie de T. pallidum antígenos cuota única, patógenos restringido 6 7 8 contra el que se han desarrollado anticuerpos monoclonales. 9 , 10 El propósito de este estudio fue determinar si las espiroquetas en la placa dental asociados con la gingivitis ulcerativa o antígenos de patógenos-Acciones Restringidas periodontitis crónica con treponemas patógenos .

MÉTODOS

Sujetos

Gingivitis y periodontitis ulcerativa fueron diagnosticados según criterios clínicos establecidos. 11 ,12 Todos los sujetos se encontraban en buen estado de salud excepto por tener gingivitis o periodontitis. Todos los sujetos del estudio no reportaron antecedentes de cualquier enfermedad por espiroquetas. Ninguno tenía evidencia clínica de la sífilis, y ningún tema fue considerado como de alto riesgo para la sífilis.

La placa fue recogida por encima y por debajo de la cresta gingival (agrupados placa supragingival y subgingival) de 10 sujetos sin evidencia de enfermedad periodontal inflamatoria (5 mujeres y 5 hombres, con una media [± DE] edad, 22,8 ± 3,1 años), y la placa subgingival fue recogidos de otros 14 sujetos sin evidencia clínica de enfermedad periodontal en cualquier sitio (7 mujeres y 7 hombres, con una media de edad, 34,1 ± 10,3). Esta última placa fue recogida de 17 pacientes en los sitios afectados por la gingivitis ulcerativa (9 mujeres y 8 hombres; media de edad, 27,2 ± 5,7) y de 19 pacientes en los sitios afectados por periodontitis moderada a severa crónicas del adulto (5 mujeres y 14 hombres; media de edad, 47,0 ± 15,0). Aunque se hizo un esfuerzo para recolectar muestras de uniformes de la placa, no se estandarizaron según el peso u otras características físicas. Las muestras se dispersaron suavemente en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,0), y partes alícuotas de 20-mu l se depositaron sobre portaobjetos de vidrio y se secó al aire.

Análisis serológico y Inmunoblotting

Para el análisis del suero, se recogió sangre de 18 pacientes con encía clínicamente sanos (11 mujeres y 7 hombres; media de edad, 35,9 ± 11,8 años) y 19 pacientes con gingivitis ulcerativa (8 mujeres y 11 hombres, con una media de edad, 27,7 ± 7,2). Las muestras de suero de los cinco pacientes con sífilis no tratada (D-51-81, D-112-82, D-208-83, D-275-86 y D-218-88) se obtuvieron de los Centros para el Control de Enfermedades (Atlanta ) y se utilizaron como controles positivos.Las muestras de suero no se disponía de los pacientes con periodontitis. 13

Se examinaron muestras de suero de 19 pacientes con gingivitis ulcerativa, 18 sujetos con encía sana, y 5 personas con sífilis para la reactividad con el uso de la prueba de laboratorio de investigación de enfermedades venéreas y la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes de acuerdo con los procedimientos recomendados. 13

Las muestras de suero se evaluaron también para IgG dirigidos contra los antígenos de T. pallidumsubespecie pallidum (cepa Nichols) por inmunotransferencia como se describió anteriormente. 14

Anticuerpos monoclonales

El anticuerpo monoclonal H9-1 reacciona con un epítopo específico de patógeno en una molécula de 47-kd de T. pallidum subespecie pallidum y pertenue . 9 , 10 El anticuerpo monoclonal B1A1, también dirigido contra un determinante específica de un patógeno en una molécula de 47-kd de T.pallidum subespecie pallidum , reacciona en el ensayo de inmunofluorescencia y ensayo inmunoenzimático con T. pallidum subespecie pallidum y pertenue pero no con T. phagedenisbiotipo Reiter (Lukehart S: datos no publicados). El anticuerpo monoclonal H9-2 reacciona con un epítopo específico de patógeno en el 37-kd molécula endoflagellar-vaina de T. pallidum . 9 , 15 El anticuerpo monoclonal C2-1 reacciona con todos los tipos de espiroquetas probados, incluyendo Leptospira, Borrelia y Treponema cultivables y no cultivables, pero no con las bacterias nonspirochetal ( Neisseria gonorrhoeae o Chlamydia trachomatis ). 9 , 16

Cada anticuerpo monoclonal se probó en el ensayo de inmuno reactividad con T. phagedenisbiotipo Reiter (regalo de JN Miller, UCLA), T. scoliodontum (regalo de JN Miller), T. vincentii (regalo de JN Miller), T. Marteilia (regalo de R. George, Centros para el Control de Enfermedades),Fusobacterium periodonticum (American Type Culture Collection [ATCC] 33693), T. denticola(ATCC 33520 y 33521), T. pectinovorum (ATCC 33763), y T. socranskii (ATCC 35536).

Ensayo Inmuno

Las muestras de placa seca y de controlar las bacterias secas se examinaron en las diapositivas como se ha descrito previamente con biotina conejo anti-ratón segundos anticuerpos y estreptavidina-fosfatasa alcalina. 16 láminas fueron vistos con un aumento de 1.000 × por un observador que desconocía el origen de la muestra y el anticuerpo monoclonal utilizado. Para cada muestra, campos de alta potencia 10 no se superponen (1000 ×) se examinaron para espiroquetas manchados. Una muestra se considera positiva si se observan uno o más espiroquetas manchados.

Análisis estadístico

La significación de las diferencias en la frecuencia de observaciones positivas entre los sujetos normales y sujetos con gingivitis o periodontitis se determinó por análisis de chi-cuadrado.

RESULTADOS

Las especificidades de anticuerpos monoclonales

B1A1, H9-1 y H9-2 reaccionó sólo con T. pallidum ( Tabla 1 TABLA 1[pic 1]Reactividad de los anticuerpos monoclonales. *). G2-1 hace reaccionar con todos los treponemas probadas.

Identificación de las espiroquetas en placa

Como se muestra en la Tabla 2 TABLA 2[pic 2]frecuencia con que se detectaron espiroquetas en la placa dental mediante anticuerpos monoclonales., las 10 muestras de control de la placa supragingival, pero sólo 1 de 14 muestras de control de la placa subgingival contenían espiroquetas detectables con el anticuerpo monoclonal C2-1 (esta muestra también era reactiva con el anticuerpo monoclonal patógeno restringida H9-2). Por el contrario, los 17 pacientes con gingivitis (P <0,001) y 14 de los 19 pacientes con periodontitis (P <0,001) tenían espiroquetas en la placa subgingival. Ningún sujeto con encía sana tenía espiroquetas en la placa que dieron positivo con anticuerpos monoclonales B1A1 o H9-1, en ​​comparación con 11 de los 17 sujetos con gingivitis (P <0,001) y 10 de los 19 sujetos con periodontitis (p <0,01). Del mismo modo, sólo 1 de los 14 sujetos normales tenían espiroquetas en la placa que dieron positivo con anticuerpo monoclonal H9-2, en comparación con los 11 sujetos con gingivitis para quien las muestras estaban disponibles (P <0,001) y 14 de los 19 sujetos con periodontitis ( P <0,001).

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