BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR Y GENOMICA

CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 9.1

Análisis genético de mutaciones para identificar y estudiar genes

• Los organismos diploides tienen dos copias (alelos) de cada gen, mientras que los organismos haploides tienen sólo una copia.

• Las mutaciones recesivas conducen a una pérdida de función, la cual está enmascarada si un alelo normal del gen está presente. Para que el fenotipo mutante se presente, ambos alelos deben llevar la mutación.

• Las mutaciones dominantes conducen a un fenotipo mutante en presencia de un alelo normal del gen. Los fenotipos asociados con las mutaciones dominantes a menudo representan una ganancia de funciones, pero en el caso de algunos genes producen una pérdida de funciones.

• En la meiosis, una célula diploide realiza una replicación del DNA y dos divisiones celulares, lo que produce cuatro células haploides en las cuales los aletos maternos y paternos se combinan al azar.

• Las mutaciones dominantes y las recesivas exhiben patrones de segregación característicos en las cruzas genéticas

• En las levaduras haploides, las mutaciones sensibles a la temperatura son muy útiles para identificar y estudiar genes esenciales para la supervivencia.

• El número de genes funcionalmente relacionados involucrados en un proceso puede definirse mediante el análisis de complementación .

• El orden en el cual los genes funcionan en una vía biosintética o de señalización puede deducirse a partir del fenotipo de los mutantes dobles defectuosos en dos pasos en el proceso afectado.

• Las interacciones funcionalmente significativas entre proteínas pueden deducirse a partir de los efectos fenotípicos de las mutaciones supresoras de alelos específicas o de las mutaciones letales sintéticas.

CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 9.2

Clonación del DNA mediante métodos de DNA recombinante

• En la clonación de DNA, las moléculas de DNA recombinante se forman in vitro al insertar fragmentos de DNA a moléculas vectores de DNA. Luego se introducirán las moléculas de DNA recombinante en las células huésped, donde se replican y producen grandes cantidades de moléculas de DNA recombinante.

• Las enzimas de restricción (endonucleasas) cortan el DNA en secuencias palindrómicas específicas de 4 a 8 bp y producen fragmentos definidos que a menudo tienen colas de hebra simple autocomplementarias (extremos adhesivos).

• Dos fragmentos de restricción con extremos complementarios pueden unirse mediante la acción de la DNA ligasa para formar un DNA recombinante.

• Los vectores de clonación de E. coli son moléculas pequeñas de DNA circular (plásmidos) que incluyen tres regiones funcionales: un origen de replicación, un gen resistente a fármacos y un sitio donde puede insertarse un fragmento de DNA. Las células transformadas que transportan un vector crecen y forman colonias sobre el medio de selección.

• Los fagos son vectores de clonación que se forman remplazando partes no esenciales del genoma A con fragmentos de DNA superiores a "'25 kb de longitud y empaquetando los DNA recombinantes resultantes con cabezas preensambladas y colas in vitro.

• En la clonación de cDNA, los mRNA expresados se transcriben inversamente a DNA complementarios o cDNA. Mediante una serie de reacciones, los cONA monocatenarios se convierten a DNA bicatenarios, que pueden ligarse en un vector fago A .

• Una genoteca de cDNA es un conjunto de clones de cDNA preparados a partir de mRNA aislados de un tipo particular de tejido. Una genoteca es un conjunto de clones que transporta fragmentos de restricción producidos por escisión de todo el genoma.

• El número de clones en una genoteca o de cDNA debe ser lo suficientemente grande para que todas o casi todas las secuencias nucleotídicas originales estén presentes en, al menos, un clon.

• Un fragmento de DNA clonado en particular dentro de una genoteca puede detectarse mediante hibridación a un oligonucleótido radiomarcado cuya secuencia es complementaria a una porción del fragmento.

• Los vectores lanzadera que se replican tanto en las levaduras como en E. coli pueden utilizarse para construir una genoteca de la levadura. Los genes específicos pueden aislarse por su capacidad para complementar los genes mutantes correspondientes en las células de la levadura.

CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 9.4

Genómica: análisis amplio del genoma, de la estructura de genes y de la expresión

• La función de una proteína que no ha sido aislada a menudo puede predecirse sobre la base de las similitudes de su secuencia de aminoácidos con proteínas de funciones conocidas.

• Un algoritmo de computación conocido como BLAST busca rápidamente en las bases de datos de secuencias proteieas conocidas para hallar aquellas con una similitud significativa a una nueva proteína (consultada).

• Las proteínas con motivos funcionales en común pueden no ser identificadas en una búsqueda BLAST típica. Estas secuencias cortas pueden localizarse en búsquedas en las bases de datos de motivos.

• Una familia de proteínas comprende múltiples proteínas derivadas de la misma proteína ancestral. Los genes que codifican estas proteínas, que constituyen la correspondiente familia de genes, surgieron por un episodio inicial de duplicación de genes y la divergencia siguiente durante la evolución de las especies

• Los genes emparentados y sus proteínas codificadas que derivan de un episodio de duplicación de genes son parálogas; las que derivan de la especiación son ortólogas. Las proteínas que son ortólogas suelen tener una función similar.

• Los marcos abiertos de lectura (ORF) son regiones del DNA genómico que contienen al menos 100 codones localizados entre un codón de inicio y un codón de terminación.

• La búsqueda por computadora de las secuencias genómicas completas bacterianas y de levadura para los marcos abiertos de lectura identifica correctamente la mayoría de los genes codificadores de proteínas. Se deben utilizar varios tipos de datos adicionales para identificar genes probables en las secuencias genómicas de los seres humanos y otros eucariontes superiores debido a la estructura de genes más compleja en estos organismos.

El análisis de las secuencias genómicas completas de diferentes organismos indica que la complejidad biológica no está directamente relacionada con el número de genes codificadores de proteínas.

• El análisis de micromatrices de DNA detecta simultáneamente el nivel relativo de expresión de miles de genes en diferentes tipos de células o en las mismas células en diferentes condiciones.

• El análisis de clusters de datos de los experimentos de expresión de micromatrices múltiples puede identificar genes que son regulados similarmente en diversas condiciones. Estos genes corregulados suelen codificar proteínas que tienen funciones biológicas relacionadas.

CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 9.5

Inactivación de la función de genes específicos en los eucariontes

• Una vez que un gen ha sido clonado, pueden deducirse importantes claves acerca de su función normal in vivo a partir de los efectos fenotípicos de la mutación del gen.

• Los genes pueden ser interrumpidos en las levaduras insertando un gen marcador de selección en un alelo de un gen de tipo silvestre a través de recombinación homóloga, produciendo un mutante heterocigótico. Cuando ese heterocigoto esporula, la interrupción de un gen esencial producirá dos esporas haploides no viables .

• Un gen de levadura puede inactivarse de manera controlada utilizando el promotor GALl para interrumpir la transcripción de un gen cuando las células son transferidas a un medio que contiene glucosa.

• En los ratones, los genes modificados pueden ser incorporados a la línea germinal en su ubicación genómica original mediante recombinación homóloga, produciendo knockouts. Los knockouts en ratones pueden proveer modelos para las enfermedades genéticas humanas como la fibrosis quística

• El sistema de recombinación loxP-Cre permite la producción de ratones en los cuales se altera un gen en un tejido específico

• En la producción de organismos o células transgénicas, el DNA exógeno es integrado al genoma huésped mediante recombinación no homóloga. La introducción de un alelo dominante negativo de esta manera puede inactivar funcionalmente un gen sin alterar su secuencta.

• En algunos organismos, incluido el nematodo C. elegans, el RNA de hebra doble desencadena la destrucción de todas las moléculas de mRNA con la misma secuencia . Este fenómeno, conocido como RNAi (interferencia de RNA), provee un medio específico y potente para inactivar funcionalmente genes sin alterar su estructura.

SEÑALIZACION CELULAR

CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 13.1

Moléculas de señalización y receptores de la superficie celular

• Las moléculas de señalización extracelulares regulan las interacciones entre los organismos unicelulares y son reguladores fundamentales de la fisiología y desarrollo en los organismos multicelulares.

• La unión de moléculas de señalización extracelulares en los receptores de superficie celular activa la vía de transducción de la señal intracelular que por último modula el metabolismo celular, la función o la expresión génica.

• Las señales externas incluyen las proteínas y los péptidos anclados en la membrana y segregadas, y moléculas lipofílilipofílicas pequeñas (p. ej., hormonas esteroides,

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