CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE COMPUESTOS PRESENTES EN LA

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POTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE COMPUESTOS PRESENTES EN LA

SUBFRACCIÓN DE LAS HOJAS DE Isertia laevis (Rubiáceas) CON ACTIVIDAD

ANTICARIOGÉNICA

DIRECTORA: ALBA NOHEMÍ TELLEZ ALFONSO Dr. Sc.

ASESOR: FREDY GAMBOA

ESTUDIANTE: JOHN JAIRO ROJAS RUIZ

TESIS

Presentada como requisito parcial

Para optar al titulo de

MAGISTER EN CIENCIAS BIOLOGICAS ENFASIS

PRODUCTOS NATURALES

BOGOTA D.C. 2010

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CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE COMPUESTOS PRESENTES EN LA

SUBFRACCIÓN DE LAS HOJAS DE Isertia laevis (Rubiáceas) CON ACTIVIDAD

ANTICARIOGÉNICA

JOHN JAIRO ROJAS RUIZ

APROBADO

ALBA NOHEMÍ TELLEZ ALFONSO Dra. Sc

DIRECTORA

RODRIGO RODRÍGUEZ Ph.D.

JURADO

JORGE ROBLES Ph.D.

JURADO

JULIO PEDROZO Ph.D.

JURADO

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CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE COMPUESTOS PRESENTES EN LA

SUBFRACCIÓN DE LAS HOJAS DE Isertia laevis (Rubiáceas) CON ACTIVIDAD

ANTICARIOGÉNICA

JOHN JAIRO ROJAS RUIZ

APROBADO

MANUEL ANTONIO FRANCO

MD. Ph.D

DIRECTOR DE POSGRADOS

FACULTAD DE CIENCIAS

INGRID SCHULER

Biol. Ph.D

DECANA ACADÉMICA

FACULTAD DE CIENCIAS

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DEDICATORIA

Dedico este trabajo al Dios de mi corazón por colocarme retos y mostrarme que la

mejor compañía para afrontarlos es y será mi familia.

A Gabriela mi hijita y mi mayor pensamiento

A mi esposa por su constante apoyo ayuda y paciencia durante este tiempo.

A mi mamá, por su amor incondicional, apoyo y preocupación.

A la memoria de Ercilia Ruiz, la mujer que me enseño desde pequeño para que

sirve cada “mata”.

5

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar

la verdad y la justicia”.

6

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la Dra. Alba Nohemí Téllez, quien me enseñó a aprehender y sacarle

gusto a este trabajo, también por su colaboración y paciencia durante la

realización del mismo.

Al Dr. Freddy Gamboa, por su colaboración y explicaciones en ese mundo de la

microbiología.

A Mayra Alejandra Téllez, por su ayuda y amistad en el desarrollo de este trabajo.

A los profesores Jorge Robles, Elizabeth Gil, Rubén Torrenegra, Alix Loaiza por su

atenta ayuda, disposición, recomendaciones, durante este tiempo.

A mi esposa Sandra, un especial agradecimiento por su preocupación, aporte de

ideas, escucha y corrección durante el desarrollo de este trabajo.

A las Directivas de la Fundación Colegio Anglo Colombiano y el comité SMT por

su apoyo en mi desarrollo profesional. Como también a los profesores Keith Rigby

y James Atkinson por su apoyo y corrección de texto respectivamente.

A Diana, Camilo, Felipe e Iván por su amistad e inyección de risa y optimismo

cada tarde.

A mis compañeros de trabajo Milton Solarte, Sherie Cañon y Elsa Gómez por su

apoyo, escucha y sus siempre sabios consejos.

Un especial agradecimiento a la futura médico Angie Rincón por su ayuda desde

Calí en la toma de espectros de RMN para este trabajo.

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ABSTRACT

In the joint-project carried out by the “Grupo de Investigación en Fitoquímica” and

the “Centro de Investigaciones Odontológicas” from “Pontifica Universidad

Javeriana”, we characterized three compounds with biological anticariogenic1

activit, from Rubiáceas lsertia laevis (Triana Boom). leaf extracts and sub fractions.

The antibacterial activity was determined by bioassay obtained using on S. mutans

and S. sobrinus microorganisms associated with caries cavity. These biological

activities are recorded in the papers of undergraduate and master's thesis

developed within the aforementioned project. (ALVARADO A., 2006), y (TELLEZ

M., 2009)

The components from the active fraction were isolated and purified and their

chemical structures were determined using spectroscopic and spectrometric

methods such as RMN1H, RMN13C and high performance liquid chromatography

coupled to mass spectrometry with electrospray ionization (HPLC-ESI-MS).

The study of the anticariogenic subfraction were three components were found.

These belonged to the glycoside triterpenoid type, similar to molecules isolated

from the Rubiacea family species and its gender by Aquino, R. in 1997, and

Hietzman, M. in 2005.

1 Anticariogenic refers biological inhibition activity over caries cavity..

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RESUMEN

Dentro del proyecto 001926 desarrollado entre el grupo de fitoquímica y el Centro

de Investigaciones Odontológicos ambos de la Pontificia Universidad Javeriana, se

caracterizan tres compuestos a partir de la fracción con actividad anticariogénica2

obtenida a partir de las hojas de Isertia laevis (Triana, Boom)

Se determina la actividad anticariogénica por bioensayos de las fracciones

obtenidas usando S. mutans y S. sobrinus, microorganismos relacionados con la

caries dental. Estas actividades biológicas se registran en los trabajos de grado y

tesis de maestría desarrolladas dentro del proyecto mencionado. ALVARADO y

TELLEZ et.al. 2009

Se realiza entonces la separación e identificación de los componentes de la

fracción anticariogénica, el aislamiento y se realiza su elucidación química

estructural por medio de métodos espectroscópicos como RMN1H, RMN13C y

cromatografía liquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas con

ionización por electrospray (HPLC-ESI-MS).

Del estudio de la subfracción activa anticariogénica, se encontraron tres

compuestos del tipo triterpeno glicosilado. Compuestos similares y con actividad

biológica han sido reportados entre el género Isertia y la familia Rubiáceas por

Aquino, R., en 1997, y Hietzman, M., en 2005.

2 Anticariogenico concepto utilizado por CHUNG, J., en 2006 para designar la actividad inbitoria de

extractos sobre bacterias asociadas a la caries dental.

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INDICE DE ABREVIATURAS

AcOEt : Acetato de Etilo

Ac : Radical Acetil

Api : Β-D-apiosa (furanosa)

ATCC : American Type Culture Collection

CC : Cromatografía en Columna

CHCl3 : Cloroformo

CH2Cl2 : Diclorometano

ESI : Ionización por Electrospray

ESI+ : Ionización por Electrospray modo positivo

ESI- : Ionización por Electrospray modo negativo

EtOH : Etanol

Glc : D-Glucosa

H2O : Agua

HPLC : Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia

m.s.n.m. : Metros sobre el nivel del mar

MeOH : Metanol

MS : Espectrometría de Masas

MSn : Espectrometría de Masas tándem ó secuencial

Petrol : Eter de Petróleo

P.f. : Punto de Fusión en °C

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Rf : Cociente entre Desplazamiento de la muestra y el

frente de solvente.

RMN 13C : Resonancia Magnética Nuclear de Carbono 13.

RMN 1H : Resonancia Magnética Nuclear de Hidrogeno.

RP-18 : Fase reversa de 18 Carbon

Sephadex : Cromatografía de Inclusión Exclusión con

adsorbente Sephadex® LH-20

TLC : Cromatografía en Capa Fina

VCC : Cromatografía en Columna al Vacío

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TABLA DE CONTENIDO

DEDICATORIA 4

NOTA DE ADVERTENCIA 5

AGRADECIMIENTOS 6

ABSTRACT 7

RESUMEN 8

ABREVIATURAS 9

TABLA DE CONTENIDO 11

INDICE DE FIGURAS 13

INDICE DE TABLAS 15

1. CAPITULO I: INTRODUCCIÓN 16

1.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 18

1.2 JUSTIFICACIÓN 18

1.3 OBJETIVOS 19

1.3.1 Objetivo General 19

1.3.2 Objetivos Específicos 19

2. CAPITULO 2: MARCO TEÓRICO 20

2.1 De las Rubiáceas 20

2.1.1 Morfología General de las Rubiácea 20

2.1.2 Inflorescencias y Flores 21

2.1.3 Las Estipulas 22

2.1.4 Frutos 22

2.1.5 Usos 22

2.1.6 Química de las Rubiáceas y Quimiotaxonomía 23

2.2 Del Género Isertia 26

2.3 Isertia laevis (Triana) Boom 28

2.3.1 Morfología de la Isertia laevis 30

2.3.1.1 Estipulas y Coléteres 31

2.3.1.2 Hojas de Isertia laevis 32

2.3.1.3 Inflorescencias y flores Isertia laevis 32

12

2.3.1.4 Frutos Isertia laevis 33

2.3.2 Química de la Isertia laevis 33

2.3.3 Actividad Biológica 35

2.4 Caracterización Estructural 36

2.4.1 Cromatografía Líquida de alta Eficiencias Acoplada a

Espectrometría de masas.

36

3 CAPITULO III: PARTE EXPERIMENTAL 40

3.1 Recolección y tratamiento del material vegetal 40

3.2 Obtención de extractos y fracciones activas 41

3.3 Ensayos Químicos preliminares 47

3.4 Preparación de las Subfracciones Activas para Ensayos

espectrométricos y espectroscópicos.

48

3.5 Purificación de la muestra para RMN 1H y RMN 13C 49

4. CAPITULO VI: RESULTADOS Y DISCUSIÓN

...