Caracterización Molecular Con Marcadores RAM De árboles Nativos De Psidium Guajava (guayaba) En El Valle Del Cauca

Caracterización molecular con marcadores RAM de árboles nativos de Psidium guajava (guayaba) en el Valle del Cauca

Hilsy L. Sanabria O. , Mario A. García , Jaime E. Muñoz , Héctor A. Díaz

COMPENDIO

Se evaluaron 53 accesiones de Psidium guajava Valle del Cauca, utilizando marcadores microsatélites aleatorios RAM. Los seis primeros usados generaron 74 bandas polimórficas, con pesos moleculares de 100 a 700 pb. El porcentaje de loci Polimórfico en cinco de los primeros resultó ser del 100% (P<0.05) y la diversidad génica de 0.4386. El Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) reveló que el 64.51% de la varianza total haplotípica contabiliza para variaciones dentro de transectos. El análisis de clasificación reflejó un agrupamiento que no correspondía a un patrón geográfico, lo cual indica que la especie de guayaba tiene alta diseminación. El análisis conjunto de las características morfológicas y moleculares suministró una caracterización confiable. La variación total de los descriptores morfológicos y valores moleculares fue explicada en un 77.58% mediante CP, donde las variables originales alcanzaron valores de comunalidad desde 57.22 a un 95.99% dentro de cinco variables sintéticas generadas. El ACM permitió caracterizar las accesiones en cuatro grupos, en los cuales según el análisis discriminante casi el 100% de las accesiones quedaron debidamente clasificadas.

Palabras claves: Psidium guajava, accesiones, biodiversidad, marcadores genéticos, análisis molecular, clasificación.

ABSTRACT

Molecular characteristics of Psidium guajava in the Cauca Valley, Colombia. 53 accessions of Psidium guajava were collected in 9 zones of the Valley of the Cauca. The accessions were characterized molecularly by Microsatellite Amplificated Random RAMs, with the purpose to estimate the diversity and genetic structure that this specie possesses. Six primers were utilized and generated 74 polymorphisms bands with molecular weights from 100 to 700 pb. Five primers resulted to be 100% (P<0.05) polymorphic and the estimated gene diversity was 0.4386. The Analysis of Molecular Variance (AMOVA) showed that the 64.51% of the haplotypic total variance counts for variations whitin transects, while the 35.49% remainder is due to differences among transepts or populations. The analysis of classification reflected a grouping that did not correspond to a geographical distribution evaluated, which indicates that the species of Psidium has a high dissemination. The altogether analysis of the molecular and morphological characteristics supplied a dependable characterization. The total variation of the descriptors morphological and molecular values was explained in a 77.58% by analysis of principal components (PCA), where the original variables showed communal values since 57.22 to a 95.99% within five generated synthetic variables. The MCA, permitted to characterize the 53 accessions in four groups, in which according to the discriminant analysis almost all of the 100% of the accesions remain properly classified.

Keywords: Psidium guajava, accessions, biodiversity, genetic markers, molecular analysis, classification.

INTRODUCCIÓN

La variabilidad genética de las especies se pre¬senta como respuesta evolutiva al interaccionar con diferentes ambientes y afecta la variación de nucleó¬tidos dentro del genoma, provocando cambios en las proteínas. Esta variación puede ocurrir en varios loci de un cromosoma (Bisby & Coddinton, 1995, citado por Gaitán, 2003).

Al caracterizar una especie se está estimando la variabilidad existente en el genoma vegetal de la población de individuos que la conforman, así toda la información codificada por los genes establece su identidad morfológica (Franco e Hidalgo, 2003).

La diversidad genética es la base para la selección de variedades sobresalientes, promisorias o mejoradas dentro de un contexto frutícola en particular. La gua¬yaba, por ser una especie de polinización cruzada o alógama, principalmente dado el sistema predominante de explotación en que se encuentra en el país, se cruza naturalmente con otras variedades dando origen a ge¬notipos diferentes en apariencia, producción y calidad (Lozano et al., 2002).

La diversidad genética de las especies vegeta¬les se ha estudiado directamente a nivel del ADN o indirectamente a través de marcadores moleculares (Pérez y Ramírez, 1999). Los marcadores molecula¬res de tipo RAM (Random Amplified Microsatellite) son favorables para evaluar la diversidad genética en plantas y animales, muestran la base misma de la varia¬ción de los individuos, permiten seleccionar regiones concretas dentro de la molécula de ADN para estudios determinados, el número de polimorfismos detectables es teóricamente ilimitado y permiten analizar toda la información (Zietkiewicz et al., 1994).

Esta investigación tuvo como objetivo principal caracterizar molecularmente con el marcador RAM los árboles nativos de Psidium guajava en el Valle del Cauca. Además realizó el análisis conjunto de la información morfológica (Sanabria et al., 2005) y molecular.

MATERIALES Y METODOS

La caracterización de las accesiones de Psidium guajava se realizó en el laboratorio de Biología Mo¬lecular de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.

Se extrajo el ADN a muestras de hojas jóvenes conservadas en nitrógeno líquido, mediante el kit DNeasy plant (QIAGEN, 2004). Para evaluar la diver¬sidad genética, las muestras de ADN se probaron con 6 “primer” o cebadores sintetizados por Technologies Inc (Tabla 1).

Para la estandarización de las condiciones de cada uno de los cebadores, se preparó una mezcla de reacti¬vos en un tubo estéril de microcentrífuga (1.5 ml) para un volumen final de 25 μl (Tabla2). Los seis primers o cebadores se probaron con las muestras colectadas. La amplificación se produjo en un termociclador PTC-100 Programmable Termal Controller de MJ Research, Inc. La desnaturalización inicial fue de 95 ºC durante 5 minutos; desnaturalización a 95 ºC por 30 segundos. Hibridación a una temperatura de 50ºC (primer AG y CA), 55ºC (primer CCA-TG-CT) y 58ºC (primer GT-CGA) durante 45 segundos, una extensión de 72 ºC por 2 minutos, 37 ciclos desde la desnaturalización a extensión y por último una extensión a 72 ºC durante 7 minutos. El producto amplificado se observó mediante electroforesis en geles poliacrilamida a 160 voltios por 1 hora.

Análisis de diversidad y estructura genética

Para evaluar diversidad genética se estimó la heterocigosidad insesgada y el porcentaje de loci polimórfico al 95% mediante el programa TFPGA® (Tools for population genetic analyses, versión 1.3, 1997). La estructura genética se infirió del análisis de varianza molecular (AMOVA) basado en las frecuen¬cias génicas de las 9 poblaciones como un grupo en dos niveles jerárquicos (entre y dentro de transectos) y la diferenciación entre poblaciones se estimó a través de Fst por pares de poblaciones mediante el programa Arlequín Ver 2000 (Weir y Cockerham, 1984 y Excofier et al., 1992). Las distancias se calcularon mediante las distancias mínimas insesgadas de Nei (1978) y el dendrograma se construyó con el programa TFPGA.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los “primers” o cebadores generaron 74 bandas polimórficas, un número superior al trabajo de Rueda (2003) y suficientemente confiable para el análisis estadístico (Nybom y Bartish, 2000).

Los “primers” o cebadores fueron altamente polimórficos con valores de 88 al 100 %, igualmente presentaron valores altos de heterocigosidad insesga¬da, con un valor mínimo de He= 0.4025 para el primer TG y un máximo He = 0.4493 para el primer CGA, la diversidad promedio fue He=0.4386 (Tabla 3 y Fig.1). Poco se conoce de reportes de diversidad genética en guayaba, con excepción de un análisis de diversidad media (Hs), dentro de un grupo de 20 accesiones de Psidium guajava colectadas en América (Rueda, 2003), en el que obtuvo un valor de 0.1975; por tanto puede decirse que existe alta diversidad genética en las acce¬siones colectadas en el Valle del Cauca.

Estructura y diferenciación genética

El Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) reveló que el 64.51% de la varianza total haplotípica contabiliza para variaciones dentro de transectos, mien¬tras que el 35.49% restante se debe a diferencias entre transectos o zonas (Tabla 4).

El valor de FST promedio de los nueve transectos 0.3549, mostró una diferenciación genética muy grande entre las zonas de colecta de Psidium guajava evaluados en el Valle del Cauca.

Valores de FST pareados entre transectos mostraron diferencias significativas (P<0.05) entre todas las zonas muestreadas, con excepción de Candelaria y UNAL. No se conoce la historia genética de estas dos últimas poblaciones de guayaba para poder inferir sobre la razón de la no diferenciación genética.

A pesar de que los análisis de estructura y diferen¬ciación genética mostraron alta diferenciación genética entre transectos, no se descarta la existencia del flujo genético entre transectos, debido a que por lo general las semillas son diseminadas por aves o murciélagos frugívoros, monos, ganado, etc. y el hombre (Rodríguez et al., 1991). Por lo anterior, es posible que en el análi¬sis de clasificación a partir de las distancias genéticas de Nei-Li (1978) (Figura 2), algunas accesiones no se agrupen de acuerdo con el origen; no obstante si ha habido diseminación, parece que aún no ha tenido efecto influyente sobre la estructura poblacional. Sin embargo, no existe suficiente

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