DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD (MICROENSAYO)
brengarcialApuntes26 de Octubre de 2020
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1.- Materia: LABORATORIO DE METODOS DE ANÁLISIS.
2.- Practica: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD (MICROENSAYO).
3.-Alumno: GARCÍA LÓPEZ BRENDA.
4.-Grupo: 5QV1.
5.-Profesor: ARTURO RIVAS FARIAS.
6.- Fechas de realización: 12 y 14 de octubre de 2020.
7.- Fecha de entrega: miércoles 21 de octubre.
8.- Situación escolar: INSCRITO
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD (MICROENSAYO).
OBJETIVOS.
- Cuantificar la concentración de proteína en una muestra por medio del método de Bradford.
- Determinar el tipo de interferencia ocasionada por sustancias no proteínicas en la determinación por el método de Bradford.
- Medir la imprecisión e inexactitud del método de Bradford.
- Determinar si existe diferencias estadísticamente significativas entre el método de BCA (método estándar) y Bradford (método a prueba) en cuanto a precisión y exactitud.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME:
Tabla 1. Curva de calibración de albúmina.[pic 1]
Concentración de albumina (μg/mL) | A595 |
4 | 0.141 |
4 | 0.135 |
8 | 0.232 |
8 | 0.219 |
12 | 0.301 |
12 | 0.303 |
16 | 0.36 |
16 | 0.355 |
20 | 0.438 |
20 | 0.426 |
Pendiente: 0.018 Ordenada: 0.075 Coeficiente de correlación: 0.9963[pic 2][pic 3]
Ecuación para el cálculo de la concentración: x=A595 – 0.075 / 0.018
Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico.
Tubo | A595 | Concentración de albumina (μg/mL) |
1 | 0.318 | 13.5 |
2 | 0.334 | 14.3 |
3 | 0.322 | 13.7 |
4 | 0.327 | 14.0 |
5 | 0.314 | 13.2 |
6 | 0.327 | 14.0 |
7 | 0.303 | 12.6 |
8 | 0.309 | 13.0 |
9 | 0.308 | 12.9 |
10 | 0.309 | 13.0 |
Media | 13.4 | |
s | 0.56 | |
S2 | 0.31 | |
% CV | 4.10 | |
% Er | 11.66 | |
I.C de la media | L.I 12.9 L.S 13.8 |
Imprecisión: 4.10% (precisión = 95.9%) Inexactitud: 11.66% (exactitud = 88.34%)[pic 4]
[pic 5]
Diferencias de imprecisión entre el método de BCA y el método de Bradford.
Prueba F de Fisher.
Planteamiento de pruebas de hipótesis
Ho: S2Bradford = S2BCA
Ha: S2Bradford ≠ S2BCA
Condición para aceptar Ha: Fcal ≥ Ftablas
[pic 6]
Diferencia de inexactitud entre el método de BCA y el método de Bradford.
Prueba t-student.
Planteamiento de hipótesis.
Ho: XBradford = XBCA
Ha: XBradford ≠ XBCA
Condición para aceptar Ha: t cal ≥ t tablas.
[pic 7][pic 8]
Tabla 3. Comparación de ambos métodos.
Método | Media | S2 | n |
Bradford | 13.4 | 0.31 | 10 |
BCA | 12 | 0.84 | 10 |
Tubo | Sustancia | A595 | Concentración de albumina (μg/mL) | Tipo de interferencia generada. |
1 | Fenol al 0.2% | 0.343 | 14.8 | Positiva |
2 | Detergente comercial al 0.2% | 0.194 | 6.6 | Negativa |
3 | SDS al 0.2% | 0.178 | 5.7 | Negativa |
4 | Mercaptoetanol al 0.002% | 0.321 | 13.6 | Ninguna |
5 | EDTA 6 mM | 0.306 | 12.8 | Positiva |
Tabla 4. Efecto de sustancias no proteínicas en el método del BCA.
[pic 9]
DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Lo obtenido en la figura 1 nos arroja que la determinación por este método es fiable ya que el coeficiente de correlación es de 0.99, el trabajo del analista, las muestras y los equipos nos brindaron una buena cuantificación de la albumina presente en la muestra. La ley de Bouguer y Beer se cumple en un intervalo de concentración de albumina de 4 a 20 µg/mL.
En cuanto al análisis estadístico del método obtuvimos que la media fue de 13.4, mientras que nuestra media esperada es de 12, que es la concentración de nuestro tubo muestra (3), al obtener un valor mayor infiero que el analista no realizo bien las adiciones de los volúmenes de las diluciones y que añadió de más, pudo ser de reactivo o de proteína y agua.
El dato obtenido del coeficiente de variación = 4.10, nos indica que hay 4.10% de imprecisión y 95.9% de precisión, el analista está dentro de lo aceptado dé % de imprecisión que es de 7.5%, aun sabiendo que en la media hubo una variación este dato nos arroja que no fue significativa; en cuanto al dato de error relativo = 11.66 indica que hay 11.66% de inexactitud y 88.34% exactitud, el valor máximo aceptado de inexactitud es de 7.5%, se pasa por mucho y esto nos indica que nuestros equipos estaban mal calibrados, específicamente la micropipeta, esto podría explicar por qué adiciono de más en los volúmenes. Podríamos pensar que en la adición de agua y proteína es donde estuvo el error ya que se tenia que tomar menor volumen que de reactivo de Bradford.
Los datos observados en la Tabla 4 indican que para la cuantificación de albumina por el método de Bradford casi todas las sustancias no proteínicas que se analizaron nos arrojan interferencias positivas que nos hacen creer hay mayor cantidad de proteína y negativas que nos hacen creer hay menos cantidad de proteína en la determinación. Con base en la literatura se tiene que hay interferencia por agentes alcalinos como es el SDS y en gran medida se ve afectado por la presencia de detergentes. Por otra parte, la presencia de EDTA interfiere muy poco en el método, mientras que no se ve afectado por compuestos fenólicos y agentes reductores (mercaptoetanol).
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