Desafío en el hallazgo de nuevos fármacos contra la tuberculosis

Pontificia  Universidad Católica de Chile[pic 1]

Facultad de Química

Departamento de Farmacia

Desafío en el hallazgo de nuevos fármacos contra la tuberculosis

Integrantes: Matías Arias D.

Javier Canales A.

Matías Curihual G.

Joaquín Díaz V.

Abraham Hernández V.

Macarena Herrera H.

Profesor: José Fuentealba E.

Ayudante: Enzo Pérez V.

Hipótesis: SQ109 al inhibir la proteína transportadora MMPL3, disminuye la traslocación de ácidos micólicos, lo que vuelve más susceptible a la bacteria al interior de los macrófagos.

Objetivo General:

Demostrar que la inhibición de MMPL3 mediante el uso de SQ109 conlleva a la diminución de la supervivencia de la micobacteria.

Objetivo Específicos:

• Usar un modelo de privación de nutrientes por 2 semanas  para analizar como SQ109 afecta la supervivencia bacteriana.

• Usar un modelo de privación de nutrientes por 6 semanas  para analizar como SQ109 afecta la supervivencia bacteriana.

• Usar un modelo de hipoxia para medir la supervivencia de poblaciones de micobacterias en presencia de SQ109

• Analizar cuantitativamente la exportación de lípidos en presencia de SQ109.

Introducción.

La bacteria responsable por la tuberculosis ha generado en los últimos años los brotes más grandes de la enfermedad en toda la historia de la humanidad, esta situación es posiblemente explicado por el hecho de que la bacteria ha podido generar resistencia a los antibióticos que normalmente se usan para el tratamiento de la tuberculosis, además es conocido que la bacteria (Mycobacterium tuberculosis) es una micobacteria, por lo cual posee una pared celular particularmente resistente y menos permeable que otras bacterias, esto posiblemente debido a que en su pared celular hay presentes estructuras con ácidos micólicos, lo cual otorga  mayor grosor y otras propiedades anteriormente nombradas.

 Debido a la necesidad de encontrar nuevos fármaco para el tratamiento de esta delicada infección se han obtenido moléculas como SQ109, la cual es una molécula que ha tenido excelentes propiedades para tratar la tuberculosis, mostrando entre muchas ventajas el efecto sinérgico con otro tipo de drogas para el tratamiento de dicha infección como lo son isoniazida o rimfapicina. La importancia de esta molécula es que ha mostrado utilidad en el tratamiento de casos en que la bacteria presenta una resistencia a múltiples drogas (MDR o multi-drug resistance), particularmente este caso es cuando los fármacos nombrados anteriormente, conocido como la primera línea de tratamiento para la tuberculosis, han fracasado.  Para comprobar los efectos de inducción de vulnerabilidad de SQ109 sobre la Mycobacterium tuberculosis se hicieron varios experimentos, los cuales incluyen el desarrollo de la bacteria en presencia del fármaco, y bajo condiciones desfavorables para su desarrollo.

 Cabe señalar que MMPL3 es un familia de proteínas transportadoras, las cuales permiten la translocación del ácido micolico hacia el espacio periplasmico, en forma de monomicolatos de trehalosa, los cuales se empiezan a acumular. Además parece apropiado comentar que la formación de la pared celular se debe hacer con dimicolatos de trehalosa, por lo que se tiene cuenta de que no se inhibe la biosíntesis de ácidos micólicos, sino que solo la transportación a través de MMPL3.

Materiales y métodos.

 Cultivo celular: Se incubaron micobaterias de la cepa smegmatis y H37Rv en condiciones especiales para su crecimiento Middlebrook 7H9, un agar líquido para el desarrollo ideal especifico de las micobacterias tuberculosas y en hipoxia con azul de metileno como indicador de agotamiento de oxígeno para posteriormente ser evaluada la concentración mínima inhibitoria.

  Determinación de la CIM: Se realizó la medición en relación a SQ109 con ayuda de un test con resazurina, un colorante de presentación en sal sódica utilizado comúnmente como indicador de óxido reducción y para medir respiración aeróbica. En este caso para evaluar crecimiento celular. Alternativamente con ensayo de microplato alamar azul (MABA) como tinción o ensayo de recuperación baja de oxigeno (LORA) basado en luminiscencia.

  Modelo de privación de nutrientes: Se aplicó un ambiente privado de nutrientes para imitar las condiciones de la bacteria latente en el interior del macrófago. Esto en constante agitación mecánica por 2 y 6 semanas para luego exponerlos a la acción de antibióticos (isoniazida, rifampicina, sq109, DA5) y así compararlos con muestras controles sin antibióticos. La cuantificación fue hecha mediante CFU. Este experimento se realizó dos veces en dos lotes de cultivo independientes.

Radiomarcación, extracción y análisis:  Se marcaron los lípidos de la bacteria de la tuberculosis con [4,5-3H]l-leucine, [1-3H]N-acetyl-d-glucosamine, and [5,6-3H]uracil y 14C-acetato para comprobar si SQ109 efectivamente translocaba los ácidos micólicos o afectaba otra vía.

Cromatografía de capa fina: Se realizó esta cromatografía para analizar los lípidos a translocar para la pared celular. Se utilizó un placa de gel de sílice y diferentes solventes según la naturaleza de los lípidos. Se procedió usando una cromatografía bidimensional, las placas fueron secadas al aire y visualizadas con un equipo adecuado.

Citometría de flujo: es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser, empleada en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas, presencia de biomarcadores, y en la ingeniería de proteínas. En los citómetros de flujo, las células suspendidas en un fluido atraviesan un finísimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz láser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las células a través del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detección, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamaño y complejidad de las células. También permite el análisis multiparamétrico simultáneo de otras características físicas y químicas, evaluando en promedio más de dos mil partículas por segundo.

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