EXAMEN PARCIAL DE DIFERENCIACIÓN Y DESARROLLO

1 ER EXAMEN PARCIAL DE DIFERENCIACIÓN Y DESARROLLO

1.           Muchos genes tienen funciones únicas durante el desarrollo y se activan solamente durante ciertas etapas y ciertos grupos de células. En consecuencia, la estabilidad y/o degradación de los mensajeros y de las proteínas que resultan de su traducción son relevantes en los procesos de diferenciación.

Tomando esto en consideración, analice un ejemplo en que la expresión diferencial del gen haya sido estudiada, ya sea este un modelo de estudio animal o vegetal, indicando los mecanismos implicados en su regulación transcripcional y/o traduccional y el efecto que la mutación de estos tendrá sobre el desarrollo del organismo.

Diferentes alteraciones de los genes podrían incidir en la reproducción femenina, entre las que se destacan, mutaciones génicas en el cromosoma X, mutaciones de los genes en las hormonas esteroideas sexuales, en los esteroides suprarrenales y en los receptores hormonales nucleares. Las mutaciones en los genes que codifican varios factores involucrados en los receptores hormonales nucleares esta, SF1 que está involucrado en el desarrollo y la diferenciación del aparato reproductor.

SF1 (codificado por NR5A1) es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares que regula la transcripción de al menos 30 genes implicados en el desarrollo gonadal, el desarrollo suprarrenal, la esteroidogénesis y la reproducción. La eliminación completa del gen que codifica Sf1 en ratones da como resultado la apoptosis de la gónada en desarrollo y la glándula suprarrenal durante el desarrollo embrionario temprano. Los animales 76 XY son fenotípicamente femeninos y tienen estructuras müllerianas persistentes. También se describen anomalías del hipotálamo ventromedial y la variable HH.

SF1 actúa con SRY para activar la expresión de Sox9, lo que desencadena la cascada masculina. Posteriormente, se requiere la expresión de Sf1 en células de Sertoli para la regulación de la hormona anti-Mülleriana (HAM), que conduce a la degeneración de los conductos de Müller en embriones masculinos. SF1 es un regulador maestro de la esteroidogénesis, requerido para la producción normal de esteroides en las células de Leydig del testículo, las células del estroma y la teca del ovario y las células corticales de la suprarrenal. Además, se requiere la expresión de SF1 para la diferenciación normal del ovario.

De acuerdo con el papel crítico de SF1, su expresión está estrictamente regulada tanto a nivel genético como a nivel de proteínas. WT1 y CITED2 interactúan para regular la expresión de Sf1. También se informa que POD1, un factor básico de transcripción hélice-bucle-hélice, regula la expresión de Sf1 en la gónada en desarrollo. DAX1, una proteína femenina, interactúa antagónicamente con SF1 a nivel de proteína. A nivel postraduccional, se ha demostrado que la SUMOilación (La sumoilacion es una modificación postraduccional mediante la cual algunas de las proteínas celulares son modificadas mediante la adición de otra pequeña proteína llamada SUMO (small ubiquitin-related modifier)). de SF1 es necesaria para el desarrollo gonadal y suprarrenal normal. La inhibición de la SUMOilación provoca un cambio en el conjunto de genes regulados por la expresión de SF1, lo que resulta en un fenotipo poco diferenciado y mixto en la gónada y las glándulas suprarrenales.

Sf1 se expresa en las crestas urogenitales de ambos sexos desde 9 dpc, y continúa en las crestas genitales de ambos sexos hasta aproximadamente 12.5 dpc. Después de 12,5 dpc, la expresión se extingue en gónadas XX y no es detectable por hibridación in situ a 14,5 dpc. La expresión en gónadas XY continúa en niveles altos en las células de Sertoli y en las células de Leydig intersticiales hasta aproximadamente 14.5 dpc cuando la expresión se restringe a las células de Leydig y se extingue en 17.5 dpc.

SF1, también llamado Ad4BP, un receptor nuclear codificado por el gen NR5A1, regula la transcripción de una variedad de genes involucrados en la reproducción, la esteroidogénesis y la diferenciación sexual masculina. Las mutaciones de NR5A1 se han identificado en un amplio espectro de trastornos de la función gonadal y suprarrenal. El fenotipo "clásico" de SF1 es raro y se caracteriza por una alteración marcada de la función testicular y suprarrenal asociada con una mutación heterocigota de SF1.

[pic 1]

(A) Modelo de regulación de la transcripción génica mediada por SF-1 en gonadotrofos. GnRH y PACAP activan sus receptores de superficie celular para estimular la PKC, la proteína quinasa activada por mitógenos (MEK), la ruta MAPK o la adenilil ciclasa (AC), el AMPc, la ruta PKA para mejorar la fosforilación de SF-1 o los coactivadores (CoA ) / co-represores (CoR), para regular la transcripción de GSU, LH, nNOS, GnRH-R o inhibina. (B) Reclutamiento de coactivadores después de la modificación post-traduccional de SF-1. La fosforilación de SF-1 conduce a un cambio de conformación y al reclutamiento de coactivadores como CREB, Egr-1 y la proteína-1 que interactúa con el receptor de glucocorticoides (GRIP1). La acetilación de SF-1 por la histona acetiltransferasa GCN5 conduce al reclutamiento de la proteína de unión a CREB (CBP / p300).

2. La regulación de la expresión génica mediada por miRNA es un elemento de control cada vez más estudiado como un componente esencial de los mecanismos de diferenciación, tanto a nivel embrionario como en organismos desarrollados.

En función de esto, analice un ejemplo en el que la participación de estas moléculas haya sido estudiada como parte de los procesos de diferenciación de una estirpe celular, ya sea en un modelo animal o vegetal. Para este análisis, indique ejemplos específicos de los genes involucrados, señalando los posibles mecanismos en dicho proceso.

Durante el desarrollo embrionario preimplantacional existen genes como Mater, Zp1-3, Oct4 o Nanog  cuya expresión se limita a etapas muy concretas durante el desarrollo embrionario preimplantacional. Sin embargo, las proteínas codificadas en estos genes pueden estar actuando en etapas donde su expresión no es detectada. En el caso de los miRNAs, como RNAs que no codifican proteína, la interpretación de patrones de expresión única en etapas concretas del desarrollo es diferente: el análisis de su expresión marca el emplazamiento de su posible actividad funcional.  

Por otra parte, la ausencia de detección de miRNAs específicos de ovocito, sugiere que la participación de los miRNAs heredados de forma materna se extiende a etapas postcigóticas.  

La obtención de embriones en las primeras fases de desarrollo, antes de su implantación, se lleva a cabo mediante la disección del tracto reproductor. Se separa el oviducto del resto del tracto reproductor colocándolo en gotas de 100 µl de medio M2. Los ovocitos y embriones se aíslan rasgando el ámpula del oviducto. El ámpula contiene los ovocitos y embriones rodeados de células foliculares que forman un cúmulo. Para su cultivo es necesario disgregar las células foliculares y aislar los ovocitos o embriones. Esto se consigue mediante la adición de hialuronidasa (concentración final 0.3 mg/ml). Una vez separados de las células foliculares, los ovocitos o embriones aislados se someten a lavados en distintas gotas de M2 para eliminar los restos de hialuronidasa y células foliculares residuales y se almacenan a 37 ⁰C hasta su inmediata utilización. (García, L. 2011)

“Microarrays” en soporte sólido para miRNAs. El análisis de expresión global de miRNAs en ovocito y cigoto, se inició mediante la plataforma comercializada por EXIQON (versión 10.0), que contempla la detección de miRNAs de roedor (M. musculus y R. norvergicus) mediante la disposición en portaobjetos de cristal de oligonucleótidos de 7 monómeros específicos para cada miRNA, modificados mediante LNAs  

Los ovocitos y cigotos empleados fueron colectados individualmente, desprovistos de zona pelúcida y almacenados a -80 ⁰C en TRIZOL® (Invitrogen) hasta su posterior procesamiento. Se partió de 15210 ovocitos y 15416 cigotos de los cuales se obtuvieron 1,6 µg y 2,1 µg de RNA total, respectivamente. La cuantificación se realizó mediante Nanodrop-2000 y el posterior estudio de la integridad del RNA extraído se realizó mediante Bioanalyzer 2100 (García, L. 2011)

Dentro de los 58 genes de expresión única, la familia let-7 fue la más representada con cinco miembros (mmu-let-7c-1*, mmu-let-7g, mmu-let-7d, mmu-let-7c, mmu-let-7e). Los miembros de una misma familia de miRNAs presentan homología en sus secuencias.  

Dicha homología se localiza en los 7-8 nucleótidos que constituyen el sitio de unión principal al RNA mensajero diana (región “seed”) y que va a determinar en mayor medida la especificidad de la unión. De este modo, aquellos miRNAs que se encuentren en la misma familia regularán potencialmente los mismos genes (Chen and Rajewsky, 2007).

Al igual que algunos de los miRNAs de la familia let-7, dos de los miembros de la familia del miR-467 (miR-467e y miR-467d) presentaron un patrón de expresión única. El miR-467e se expresó en la etapa de cigoto mientras que el miR-467d se expresó en la etapa de blastocisto. Las etapas de dos células y mórula presentaron un gran número de genes de expresión única. Durante estas etapas se han descrito dos de los eventos claves para el desarrollo embrionario preimplantacional: la culminación del proceso de degradación de transcritos maternos (etapa de dos células) y el primer evento de diferenciación celular (etapa de mórula).

...