Eficacia de desinfectantes basados en cítricos para inhibir el crecimiento, swarming, formación de biopelicula de Salmonella y descontaminación de perejil

Eficacia de desinfectantes basados en cítricos para inhibir el crecimiento, swarming, formación de biopelicula de Salmonella y descontaminación de perejil.

Alam Garcia-Heredia1, Nydia Oruè2, Norma Heredia1 y Santos Garcìa1

1 Departamento de Microbiología e inmunología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, Apdo Postal 124-F, San Nicolás Nuevo León, México 66451. 2 Corpo Citrik SA de CV Patricio Sanz 1653, Mèxico DF 03100.

e-mail: alam@microbiosymas.com, ventas@corpocitrik.com, norma@microbiosymas.com, santos@microbiosymas.com

Recibido 17 Febrero 2013, aceptado 28 de Abril de 2013

Resumen.

Las biopeliculas permiten que las bacterias se adhieran a superficies biológicas o no biológicas y son difíciles de eliminar, mientras que swarming permite la rápida colonización de ambientes ricos en nutrientes. En este estudio, la eficacia de seis formulaciones  comerciales antimicrobianas a base de cítricos  para controlar el crecimiento, la producción de biofilm, y swarming de Salmonella fue determinado. Además, se estableció la eficacia de Citrik Agro® para desinfectar perejil contaminado.  Las Concentraciones mínimas bactericidas (CMBs) de los desinfectantes contra cinco cepas de Salmonella fueron evaluadas por el método de dilución en microplacas. Para la prueba de la motilidad Swarming, las concentraciones subinhibitorias de los desinfectantes se mezclaron con agar Luria-Bertani. La formación de biopelículas se cuantificó en microplacas con caldo después de la tinción con safranina.  El Perejil fue contaminado artificialmente con Salmonella, luego se lavó con Citrik Agro y la presencia de Salmonella se determinó después de varios días. Las CMB de los desinfectantes oscilaron desde 81 hasta 922µg / ml. Citrik AB fue el inhibidor más eficaz de crecimiento de Salmonella (CMB: 81-105µg / ml). La mayoría de los desinfectantes inhiben la formación de biopelículas en el 75% de la CMB, y se observó una reducción en concentraciones más bajas. Sin embargo, Citrik AB inhibía la formación de biopelículas, incluso a 25% de la CMB, y también produjo una mayor (P <0,05) reducción de swarming  cuando se utilizó 75% de la CMB, en comparación con los otros desinfectantes. Además, Citrik Agro redujo más de 2 log de Salmonella en el perejil. Esta reducción fue mayor (P <0.05) que la observada por el tratamiento con cloro. En conclusión, los productos a base de extracto de cítrico podrían ser una alternativa natural a reducir el riesgo de contaminación por Salmonella en productos frescos.

Palabras claves: Salmonella, verdes fresco, perejil. Extractos cítricos, desinfectantes.

Introducción

Salmonella es uno de los patógenos bacterianos más prominentes que causa una importante morbilidad, la mortalidad y carga de enfermedad a nivel mundial. En los EE.UU., Salmonella es responsable de aproximadamente un millón de casos de enfermedad y 19.586 hospitalizaciones al año1.

Las biopelículas son comunidades de bacterias estructuradas asociadas a la superficie que crecen encerradas en una matriz amorfa, extracelular que se adhieren a superficies biológicas o no biológicas y son difíciles de remover 2, 3. La adhesión y  formación de biopelículas por Salmonella en diferentes superficies de los alimentos, tales como plástico, vidrio, acero inoxidable, silicona y policarbonato, aumentan la resistencia a las tensiones ambientales, y algunas células no pueden ser eliminados durante los procedimientos de limpieza y desinfección 2, 3. Por esta razón, los desinfectantes más eficaces contra las células bacterianas en suspensión pueden no ser tan efectivos en el tratamiento de células bacterianas embebidas en una biopelicula 4.

Swarming es el modo bacteriano más rápido conocido de translocación de superficie y permite la rápida colonización de ambientes ricos en nutrientes 5. Estas motilidades contribuyen a la formación de biopeliculas 6. En el laboratorio, cuando Salmonella se propaga en medio semisólido rico en nutrientes suplementado con glucosa, se somete a la diferenciación morfológica en células swarmer, haciéndolas físicamente capaces de migrar a superficies activas 7.

Varios brotes asociados con el consumo de hortalizas de hoja verde contaminados con Salmonella se han sido documentados 8.  Perejil fresco ( Petroselinum crispum ) ha sido identificado como un vehículo de transmisión de bacterias enteropatógenas 9 , 10. La formación de biopelículas también juega un papel en la persistencia de Salmonella después del tratamiento de cloración de perejil 11. Desde que las hojas verdes se consumen regularmente frescas, y los actuales métodos de descontaminación no son siempre efectivos se requieren estrategias alternativas para su descontaminación.

Los procedimientos de lavado para los productos se diseñan para eliminar la suciedad y disminuir la contaminación microbiana adquirida en el campo durante el cultivo y la cosecha. También ayudan a prevenir la contaminación cruzada entre lotes. Los compuestos sintéticos añadidos a la solución de lavado han sido ampliamente utilizados por la industria alimentaria para reducir la contaminación microbiana; Sin embargo, en los últimos años, las tendencias de consumo se han desplazado hacia el uso de menos aditivos alimenticios sintéticos para que los productos se pueden consumir de una forma más natural o estado natural 12 .

Varios agentes antimicrobianos naturales a base de extractos de cítricos están disponibles comercialmente, pero hay poca información disponible sobre su efecto en la formación de biopelículas y Swarming de Salmonella. En este trabajo, se determinó la eficacia de seis desinfectantes a base de cítricos comerciales utilizados en la agricultura, ganadería, plásticos y las industrias de alimentos contra el crecimiento, la formación de biopelículas, y swarming de Salmonella. Además, la eficacia de una de estas formulaciones a base de cítricos para desinfectar el perejil contaminado artificialmente con Salmonella fue establecida.

Material y Métodos

Los cultivos bacterianos: Salmonella Typhi ATCC 19430, Salmonella Typhimurium ATCC 14028 se obtuvieron originalmente de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Las siguientes cepas bacterianas fueron aisladas en nuestro laboratorio: Salmonella Muenchen M59410 (de heces de pollo), Salmonella E1 monofásica (de perejil), y Salmonella spp. (De pollo crudo). Estas cepas se identificaron utilizando el sistema Biolog (Hayward, CA), confirmado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y el serotipo en el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica de México (INDRE). Todas las cepas se almacenaron a - 80 ° C en  agar infusión cerebro corazón  (BHI) (Difco) que contiene 20% (v / v) de glicerol. Los cultivos activos se prepararon mediante la inoculación de una alícuota en caldo BHI y se incubaron a 37 ° C durante 48 h. Una alícuota de esta se extendió sobre (MH) agar Mueller-Hinton (Difco) y se incubó a 37 ° C durante 24 h. Las colonias se suspendieron en solución salina y se ajustaron a 1,5 × 108 UFC / ml.

Antimicrobianos basados ​​cítricos utilizados: En este trabajo se utilizaron seis desinfectantes comerciales. Citrik AB líquido, Citrik AB en polvo se utilizan para el uso general en la industria alimentaria, Citrodex se utiliza para la desinfección de superficies, Citrol K Ultra se utiliza para el uso general en la industria alimentaria, Citrik Max se utiliza para el uso de granja, y Citrik Agro se utiliza para la desinfección de los productos agrícolas, utensilios e instalaciones. Todos los desinfectantes se obtuvieron de Corpo Citrik, SA de CV, México. De acuerdo con las especificaciones técnicas, estas formulaciones se basan en extractos cítricos "generalmente reconocidos como seguros" (GRAS).

Concentración mínima bactericida (CMB): Placas U-microtitulación estéril de poliestireno de 96 pocillos (BD Falcon, San José, CA) se llenaron con 50µl de 2× caldo MH (Difco), y 50 µl de diferentes concentraciones de los productos comerciales (diluido en agua destilada) fueron probados 13, 14. Las placas se inocularon con 1µl (1% v / v) del cultivo de cada cepa activado o un grupo de cinco cepas de Salmonella (1,5 × 108 UFC / ml) y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Después de la incubación, el contenido de cada pocillo se sembró en agar MH y se incubó a 37 ° C durante 48 h. La CMB se consideró como la concentración más baja del producto que impedía cualquier crecimiento visible de colonias bacterianas (ausencia total de colonias) en la placa de agar MH después del período de incubación de 48 h. Se llevaron a cabo experimentos separados para determinar el efecto de los desinfectantes (CMB) en el pH del caldo de MH.

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