Evaluacion qPCR

Evaluación de la qPCR, técnicas anidadas de RT-PCR y ELISA en el diagnóstico de chikungunya

La capacidad de diagnóstico definitivo de IgM ELISA, RT-PCR anidada  y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se evaluó para el diagnóstico de chikungunya utilizando 180 muestras clínicas. La qPCR en tiempo real mostró una mayor sensibilidad (88.3%) para el diagnóstico de chikungunya en las primeras etapas de la infección, mientras que el IgM ELISA demostró ser sensible para las últimas etapas de la enfermedad (81.8%). Los resultados sugieren que la aplicación de los ensayos basados en ELISA de IgM y RTPCR será ideal para el diagnóstico definitivo de Chikungunya durante los brotes.

La reemergencia del virus Chikungunya (CHIKV) se ha convertido en una preocupación importante para la salud pública en la India y en los países del sudeste asiático1. La chikungunya (CHIK) se caracteriza por manifestaciones artrálgicas agudas que obligan a las víctimas a permanecer en cama por períodos prolongados1. Debido a manifestaciones clínicas casi idénticas y La circulación en las mismas áreas geográficas, la diferenciación clínica entre las infecciones por Dengue y CHIK es difícil. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar una prueba de diagnóstico sensible y específica para CHIK. Actualmente, hay algunas herramientas de diagnóstico específicas moleculares 2–5 y serológicas6 disponibles para CHIK. Sin embargo, no hay datos comparativos disponibles sobre la sensibilidad diagnóstica y la especificidad diagnóstica de estos ensayos4,5. El método ELISA no es eficaz para detectar CHIK en etapas tempranas de la infección (1-4 días), mientras que los métodos de RT PCR tienen limitaciones para detectar la enfermedad en etapas tardías (5 días en adelante). El ensayo de diagnóstico CHIK con datos sobre la sensibilidad y especificidad del diagnóstico mejorará el diagnóstico de manera eficiente. En el presente estudio, evaluamos la sensibilidad y la especificidad del ensayo de qPCR de un solo paso basado en taqMan para la detección definitiva de CHIK y lo comparamos con los análisis de PCR e IgM ELISA anidados.

Aprobación ética: Todos los protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética Institucional para Humanos y se obtuvo un consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Ciento ochenta muestras de sangre derivadas fueron recibidas de diferentes partes de la India. Inmediatamente después de obtener las muestras, el suero se separó, se dividió en alícuotas y se analizó el ARN de CHIKV simultáneamente mediante qPCR, RT-PCR anidada e IgM específica de CHIKV mediante ELISA. El ARN se extrajo utilizando el kit de extracción de ARN viral QIAamp (Qiagen, EE. UU.) Según el protocolo del fabricante. La carga viral en muestras de suero se determinó mediante el método de cuantificación absoluta7. La PCR anidada dirigida a los genes E3 se llevó a cabo utilizando cebadores (F1, 5-CAGATACCCGTGCACATGAAGT-3 y R1,5 TGAGCTAAGTATGGTCTTGT-3) que produjeron un fragmento de 534 pb. El segundo conjunto de cebadores (F2, 5-CAGACCGATCTTCGACAACA-3 y R2, 5-TCATGACGTTGTCCTCAAGC-3) amplificó un producto de 271 pb. Se utilizó Superscript II (Invitrogen, EE. UU.) Para la transcripción inversa (42 ° C durante 1 h). Las condiciones del ciclo fueron 1 ciclo a 94 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 94C (1 min), 47C (1 min) y 72C (2 min); seguido de una extensión final de 7 min a 72 ° C. Los productos se visualizaron en gel de agarosa al 2% utilizando un sistema de documentación de gel (Alpha Innotech, EE. UU.). La detección de IgM se realizó utilizando el kit de detección CHIK IgM (NIV, India) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La especificidad de estos ensayos también se verificó en los virus de Chandipura y Dengue (serotipos 1-4) y encefalitis japonesa. El análisis de las características operativas del receptor (ROC), la sensibilidad, la especificidad y el área bajo las curvas ROC (área bajo las curvas; AUC) se calcularon como se describió anteriormente8. La asociación de los síntomas clínicos entre CHIK positivo y CHIK negativo se calculó mediante la prueba de chi cuadrado. La correlación entre el día posterior al inicio (POD) y el título de CHIKV se probó mediante la correlación de Pearson y la prueba U de Mann-Whitney.

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